A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em> In Vitro</em> Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia
Summary
Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.
Abstract
desenvolvimento neuronal adequada e função é o pré-requisito do desenvolvimento e do cérebro adulto. No entanto, os mecanismos subjacentes à formação altamente controlada e manutenção de redes neuronais complexas não estão completamente compreendidos, até agora. As questões em aberto sobre neurônios na saúde e na doença são diversas e alcance da compreensão do desenvolvimento básico para investigar patologias relacionadas com humanos, por exemplo, doença de Alzheimer e esquizofrenia. A análise mais detalhada dos neurónios pode ser realizado in vitro. No entanto, os neurônios estão exigindo células e precisam do apoio adicional dos astrócitos para a sua sobrevivência a longo prazo. Esta heterogeneidade celular está em conflito com o objectivo de dissecar a análise de neurónios e astrócitos. Apresentamos aqui um ensaio de cultura de células que permite a co-cultura a longo prazo de neurónios e astrócitos primários puros, que partilham o mesmo meio definido quimicamente, sendo fisicamenteseparados. Nesta configuração, as culturas sobreviver por até quatro semanas e o ensaio é adequado para uma diversidade de investigações relativas a interação neurônio-glia.
Introduction
Ao longo das últimas décadas, a interpretação geral da função neuroglia evoluiu a partir da atribuição de um apoio meramente no sentido de um papel regulador activa a respeito da função neuronal 1. Por causa de seu impacto importante na homeostase cerebral na saúde e na doença 2, os astrócitos são de especial interesse para a comunidade científica. Nos últimos anos, uma diversidade de estudos concentraram-se em interacções neurónio-glia in vivo e in vitro 3. No entanto, a maioria dos sistemas de cultura não permitem a análise em separado de ambos os tipos de células e de seus respectivos secretomes.
Várias abordagens explorar o co-cultivo direta dos neurônios e da glia para alcançar a sobrevivência duradoura e de desenvolvimento da rede neuronal fisiologicamente relevante 4-6. O presente protocolo atinge os mesmos objetivos, mantendo ambos os tipos de células separadas fisicamente 7. Em comparação com conditioned média se aproxima de 8,9, o nosso sistema permite estudar a comunicação bidirecional entre neurónios e astrócitos. A expressão de moléculas de sinalização segregadas pode ser monitorizada, enquanto as células maturam no meio compartilhado. Esta possibilidade é especialmente relevante, tal como astrócitos libertam factores solúveis, tais como citoquinas, factores de crescimento e moléculas da matriz extracelular 10,11, regulando desse modo o crescimento neuronal e função 7,12. Assim, foi demonstrado que a adição de trombospondina de células do gânglio retinal in vitro, induz a formação de sinapses 13. No entanto, outros fatores ainda desconhecidos são necessárias para tornar as sinapses funcionais 13. Além disso, as moléculas liberadas por astrócitos têm de ser identificados, a fim de compreender a base de interações neurônio-glia.
A cultura de neurónios e astrócitos primários de ratinho e rato foi previamente descrito 14-16. Aqui nósapresentar uma ferramenta elegante e versátil para combinar ambos os tipos de células em uma abordagem co-cultura indirecta. Uma vez que as duas culturas são fisicamente separadas mas que partilham a mesma forma, o impacto de neurónios, astrócitos e as moléculas solúveis, podem ser analisados separadamente, criando assim uma ferramenta poderosa para estudos de interacção Neuron-glia.
Protocol
Representative Results
Discussion
O principal objetivo do protocolo atual é a de culturas neuronais e astrócitos completamente separadas, mantendo-os em meio compartilhado. Por esta razão, a pureza das culturas obtidas deverá ser verificada no início do procedimento. Recomendamos o uso de neurônio-específica tubulina, neurofilaments ou proteína NeuN como marcadores neuronais, GFAP como marcador de astrócitos, o antígeno O4 como marcador precursor oligodendrócitos e proteína Iba1 para identificar microglia.
Preste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
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