تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتحديد جزيئات محملة حساسية التدفق الخلوي. المحيطة جزيئات الجسيمات يمكن أن يكون بمثابة ناقلات من المواد المسببة للحساسية كثف. نعرض هنا أن التدفق الخلوي، وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع لتوصيف المواد الصلبة العالقة> 0.5 ميكرون في القطر، ويمكن استخدامها لقياس هذه الجزيئات المحملة حساسية.
Abstract
التدفق الخلوي هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لقياس المواد الصلبة العالقة مثل الخلايا أو البكتيريا في نطاق حجم من 0.5 إلى عدة عشرات ميكرومتر في القطر. بالإضافة إلى توصيف خصائص مبعثر إلى الأمام وsideward، فإنه يمكن استخدام علامات الفلورسنت المسمى مثل الأجسام المضادة للكشف عن الهياكل المعنية. باستخدام تلوين الأجسام المضادة غير مباشر، التدفق الخلوي يعمل هنا لتحديد البتولا حساسية حبوب اللقاح (الرهان على وجه التحديد ضد 1) -loaded جزيئات 0.5 إلى 10 ميكرومتر في القطر في الجسيمات استنشاق (PM10، وحجم الجسيمات ≤10 ميكرون في القطر). الجسيمات PM10 قد تعمل كحاملات للحساسية كثف ربما تنقلهم إلى الجهاز التنفسي السفلي، حيث أنها يمكن أن تسبب الحساسية.
حتى الآن محتوى حساسية من PM10 تمت دراستها عن طريق انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISAs) والمجهر الإلكتروني. إليسا يقيس المنحل وليس الجسيماتحساسية -bound. مقارنة مع المجهر الإلكتروني، والتي يمكن تصور جزيئات محملة حساسية، التدفق الخلوي قد تقدير لهم بالإضافة إلى ذلك. كما محتوى حساسية من الهواء المحيط يمكن أن تحيد عن تعداد حبوب اللقاح البتولا، قد أعراض الحساسية ربما ترتبط بشكل أفضل مع التعرض لمسببات الحساسية من حبوب اللقاح مع العد. جنبا إلى جنب مع البيانات السريرية، والطريقة المعروضة يتيح الفرصة لاختبار في التجارب المستقبلية سواء من الحساسية لجلد ترتبط مستضدات حبوب اللقاح مع المحتوى حساسية بيت الخامس 1 من الجسيمات PM10> 0.5 ميكرون.
Introduction
ويجري النظر تلوث الهواء هو من الأسباب بيئيا هاما من ارتفاع نسبة وشدة الحساسية في الجهاز التنفسي لوحظ في العقود الأخيرة 1-3. وعلاوة على ذلك، كان هناك اهتمام متزايد في توزيع المواد المسببة للحساسية شيوعا في 4،5 الغبار.
البتولا حبوب اللقاح يمكن أن تثير حمى القش ولكن يمكن أيضا أن يكون الزناد هاما من الربو التحسسي 6-8. كله البتولا حبوب اللقاح ليس من المرجح أن يدخل الجهاز التنفسي السفلي أو التي يمكن العثور عليها في PM10 نتيجة لحجمه (22 ميكرون في القطر). ومع ذلك، المواد المسببة للحساسية حبوب اللقاح البتولا مثل بيت ت 1، المكون البتولا حبوب اللقاح المسببة للحساسية كبير، ويمكن الإفراج عن بعد لقاح تمزق 9 ويمكن ربط جزيئات الهواء المحيط 10، وبالتالي ربما يدخل الشعب الهوائية الجهاز التنفسي السفلي. وبالفعل، فقد تبين أن PM10 قد تحتوي على المواد المسببة للحساسية النشطة بيولوجيا كما يتبين من في المختبر تفعيل الأسسات من حبوب اللقاح المستلفت حساسية 11 </suص>.
وقد تمت دراسة الرهان ضد المحتوى 1 حساسية في عينات PM10 عن طريق استخراج المادة المسببة للحساسية منها والكمي لاحق مع إليسا 12-14. مع تقنية ELISA، تم قياس حساسية المنحل، ولكن كمية جزيئات محملة حساسية لا يزال مجهولا. وكشف المسح المجهر الإلكتروني الجسيمات محملة حساسية ولكن لم تسمح الكمي 10،15.
وتوظف هذه الدراسة التدفق الخلوي لقياس نسبة الجسيمات PM10 بيت ت 1 تحميلها في عينات الهواء المحيط. ويرجع ذلك إلى حد الكشف عن تدفق الكريات الجسيمات فقط أكبر من 0.5 ميكرون يمكن فحصها. و> 0.5 ميكرون جزء من PM10 سيتواصل يشار إلى PM10> 0.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوة مهمة من البروتوكول هو استخدام عامل تصفية مناسبة لجمع الجسيمات PM10 من الهواء المحيط (راجع الخطوة 1.1). المرشح يجب أن يكون قويا بما يكفي لتحمل تنظيف الأسنان بالفرشاة مع فرشاة الأسنان الكهربائية، وليس كل مواد التصفية الوفاء بهذا الشرط. تأسست بروتوكول تلطيخ مع تركيز الجسيمات PM10 من 8X10 6 الجسيمات لكل مليلتر. ولكن إذا كانت المادة محدودة وتجميع عينات غير مناسب، فإن الطريقة ربما تعمل بشكل جيد، ولكن تركيز الأجسام المضادة (انظر الخطوات 3.5 و 3.8) قد تضطر إلى تعديل.
لم الرهان ضد 1 تلطيخ الجسيمات PM10 لا يؤدي إلى السكان متميزة من الجسيمات ملطخة سلبا وإيجابا. قد يكون ذلك بسبب وكميات متفاوتة من بيت ت 1 حساسية كثف إلى كل من الجسيمات التي تتراوح بين القليل جدا حتى على كمية عالية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى التوسع في إشارة APC وبالتالي تحول السكان نحوAPC الإيجابية. كما أنه من الصعب فصل إيجابية من الجزيئات السلبية، واستخدمت طريقتين الكمي لتحديد الاختلافات في المحتوى بيت الخامس 1 من PM10> 0.5 العينات: (ط) الكمي النسبي عن طريق قياس متوسط APC كثافة مضان من كل الجسيمات ، و (ب) تحديد نسبة الجسيمات الموجبة APC. وفيما يتعلق ضد 1 تحميل بيت من جزيئات من انخفاض وارتفاع حبوب اللقاح الموسم PM10> 0.5، كشفت كلتا الطريقتين نتائج مماثلة. ومع ذلك، ينصح الكمي النسبي كثافة مضان متوسط جميع الجسيمات كما هو مستقل من وضع البوابة وبالتالي أقل على الأرجح عرضة للخطأ.
حتى الآن العديد من الدراسات بفحص محتوى حساسية في المحيط الجسيمات الهواء عن طريق استخراج المادة المسببة للحساسية منها والكمي لاحق مع إليسا 5،12-14،17. هناك فرق جوهري بين الإجراء وصفها هنا وquantificatioن مع إليسا: ELISA الكمي للمستضد استخراج وحلت، في حين أن التدفق الخلوي يحلل مستضد بالجسيمات. بواسطة ELISA الرهان ضد 1 تحميل من العينات PM10 اختبار (ن = 8) كان أقل من الحد الكشف عن 1.2 نانوغرام / مل (لا تظهر البيانات). وبالمثل، حدد Buters وغيرها لا رهان ضد 1 في PM <2.5 ميكرون جزء وحوالي 7٪ فقط في 10 ميكرون> PM> 2.5 ميكرون جزء، ولكن أكثر من 93٪ في PM> 10 ميكرون جزء من الهواء المحيط 13. ، قد يكون السبب في النتائج المتناقضة لإليسا من جهة وتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من جهة أخرى من خلال أوجه الاختلاف في طريقة الكشف بالتزامن مع الحساسية المختلفة. مزيد من البحث ولكن هناك حاجة إلى فهم كامل هذا الاختلاف.
وهناك طريقة لتصور الجسيمات ملزمة مستضد والمجهر الإلكتروني 10،14. بواسطة المجهر الإلكتروني، Ormstad آخرون بيت تصور الخامس 1 على سطح لامع الجسيمات العالقةجزيئات السخام ص العينات التي أخذت في موسم حبوب اللقاح عالية وبدرجة أقل على جزيئات العينة في موسم منخفض حبوب اللقاح 15. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على المواد المسببة للحساسية من حبوب اللقاح، لاتكس، وكذلك جلوكان بيتا إلى أن كثف لجسيمات الاحتراق في الهواء المحيط 10. هذه الطريقة، ومع ذلك، لا يسمح الكمي لحساسية محددة الجسيمات.
عن طريق استخدام التدفق الخلوي، يمكن أن يكون كميا-بالجسيمات بيت ت 1 حساسية. وهكذا، التدفق الخلوي قد توفر وسيلة جديدة لوصف جزء البيولوجي للPM10 10-،5 ميكرون كما هو الحال مع الأجسام المضادة أخرى مناسبة في متناول اليد، ويمكن تمديد هذه الطريقة للكشف عن مستضدات أخرى على جزيئات الهواء المحيط، على سبيل المثال، العفن، عث الغبار المواد المثيرة للحساسية أو لبس. كما الجسيمات PM10 كثف المواد البيولوجية فحسب، ولكن أيضا المواد الكيميائية والمعادن بسهولة تامة، غير محددة ملزمة من الأجسام المضادة يمكن، مع ذلك، يشكل مشكلة. إذا تم اختبار الأجسام المضادة الجديد، خطوة حاسمة هي لإثبات مأزق معينجي. ويمكن أن يتم ذلك من خلال، على سبيل المثال، وعرقلة قدرة ملزمة من الأجسام المضادة المحددة مع المستضد المماثل السابق لتلطيخ 11.
كما بيت ت 1 المحتوى من الهواء المحيط يمكن أن تختلف من البتولا عدد حبوب اللقاح 12،13،18، قد أعراض الحساسية ربما ترتبط بشكل أفضل مع مستوى حساسية من حبوب اللقاح مع الاعتماد 14،18. وبالتالي، فإن الطريقة المعروضة بالتزامن مع البيانات السريرية يمكن أن تدرس في التجارب المستقبلية سواء من الحساسية لالبتولا تتوافق مع الحمل حساسية بيت الخامس 1 من PM10> 0.5.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.
Materials
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/h |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55mm, H 15mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1,4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
- Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?. J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
- Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
- Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
- Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
- Brough, H. A., et al. Distribution of peanut protein in the home environment. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).
- Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. The development of allergic inflammation. Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).
- World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. , 256 (2003).
- Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
- Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
- Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
- Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
- Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
- Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
- Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
- Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
- Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
- Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).
