Cytométrie en flux Analyse de la particule liée Bet v 1 Allergène en PM10

NOTE: Ce protocole décrit la coloration indirecte des particules PM10 avec un anticorps monoclonal (anticorps IgG1 monoclonal de souris, clone MA-3B4) contre Bet v 1, la principale composante de l'antigène de pollen de bouleau, plus un Allophycocyanin (APC) marqué au anticorps secondaire (anti -Mouse anticorps IgG1, le clone A85-1) et l'analyse subséquente sur un cytomètre de flux. Avec d'autres anticorps appropriés disponibles, ce procédé pourrait être étendu à la détection d'autres antigènes liés à des particules dans l'air ambiant. 1. PM10 Échantillonnage Recueillir PM10 dans l' air ambiant de polytétrafluoroéthylène (PTFE) filtres à l' aide d' un échantillonneur à faible volume avec un taux de 2,3 m 3 / h (Figure 1) d'écoulement. Une caractérisation du dispositif de prélèvement utilisé pour les expériences décrites ici se trouve dans le 16. Durée dépend de la quantité de PM10 nécessaire (généralement entre 1 et 10 jours). A la fin de la période d'incubation, enlever le filtre de l'échantillonneur et le gel au moment de-20 ° C jusqu'à utilisation. Figure 1. Faible volume de PM10 échantillonneur. Exemple d'un faible volume de sampler PM10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Retrait 2. PM10 et nombre de particules Laissez le dégel du filtre PTFE pendant environ 5 min. Ensuite, mettez le filtre dans un polystyrol propre boîte de Petri (figure 2A). Prenez une nouvelle boîte de Pétri pour chaque filtre, si plus d'un filtre est traité. Par la suite, recouvrir le filtre en PTFE avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ce protocole est établi pour une concentration en PM10 finale de 8×10 6 particules par ml (voir l' étape 3.3). Pour obtenir au moins que la concentration, utiliser le volume empirique suivante de PBS pour superposer le filtre avec: Si le temps de collecte PM10 était < 2 jours, utiliser 2 ml. Pour des temps d'incubation ≥ 2 jours, utiliser 4 ml. NOTE: Afin d'augmenter la concentration en particules de la suspension PM10, suspensions de différents filtres peuvent être mis en commun, si cela est approprié. Tenez le filtre de PTFE avec des pincettes et brosse avec une brosse à dents électrique avec une tête sensible à la brosse pendant 1 min (figures 2B, 2C). Transférer la particule-PBS-suspension, ci-après appelée suspension PM10, à un tube de réaction propre. Figure 2. PM10 retrait avec une brosse à dents électrique. Un filtre de polytétrafluoroéthylène avec échantillonné PM10 est placé dans une boîte de Pétri polystyrol (A) et est recouvert avec 4 ml de PBS. Ensuite, MP10 est enlevée avec une brosse à dents électrique (B: avant le brossage et C: après le brossage pendant 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Mesurer la concentration de particules P10, par exemple par utilisation d'un compteur de particules. Diluer un volume adéquat de PM10 suspension tels que 50 ul dans 10 ml de tampon de mesure isotonique, mesurer trois fois et calculer le nombre total moyen de particules par ml. Veillez à utiliser un compteur de particules qui permet de détecter des particules de la taille pertinente. 3. Bet v 1 Coloration Calculer le nombre de tubes de réaction nécessaires pour l'analyse de l'échantillon: au moins trois tubes de réaction sont nécessaires: (i) un tube contenant l'échantillon uniquement (contrôle natif), (ii) un tube avec l'échantillon plus un anticorps secondaire (contrôle négatif) et ( iii) un tube avec un échantillon plus anticorps primaire et secondaire (échantillon spécifique). Si elles sont mesurées pour la première fois, préparer au moins deux tubes de réaction (i) (ii),et (iii) d'avoir assez de matériel pour régler correctement les paramètres cytomètre (voir étape 4.1). Calculer la quantité de suspension MP10 nécessaire pour le nombre de tubes de réaction. Chaque tube de réaction nécessite 50 ul de la suspension. Ajuster la concentration en particules mesurée à l' étape 2.4 pour le volume de suspension calculée à l' étape 3.2 à une concentration finale de 8×10 6 particules par ml par addition d' une quantité appropriée de PBS. NOTE: La suspension de PM10 restant peut être congelé à -20 ° C pour des expériences futures, bien que pour ce protocole fraîchement préparé suspension PM10 est recommandé. Bloquer la liaison non spécifique en complétant la suspension MP10 avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) à une concentration finale de 0,02%, à l'aide d'une solution mère telle que 1% de BSA préparée avec du PBS. Vortex incuber brièvement et pendant 20 min à température ambiante. Pour chaque échantillon devant être analysé par cytométrie de flux, le transfert de 50 ul de la suspension de l'étape 3.4 à courant alternatiftube de réaction maigre. Ajouter un anticorps monoclonal de souris contre Bet v 1 à une concentration finale de 0,02 ug / ul dans les tubes de réaction désignés pour la coloration spécifique, vortex brièvement et laisser incuber pendant 60 min à température ambiante. Laissez les tubes de réaction avec la suspension PM10-BSA désigné pour le contrôle natif et le contrôle négatif aussi rester pendant 60 min à température ambiante. Laver tous les échantillons par addition de 500 ul de PBS supplémenté avec 0,02% de BSA dans chaque tube de réaction, vortex et centrifuger brièvement les échantillons par la suite à 4700 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant soigneusement à l'aide d'une pompe à vide. Répétez l'étape 3.6. Déterminer la quantité totale d'anticorps anti-IgG1 de souris marquée au secondaire APC nécessaire: 1 ug d'anticorps dissous dans 50 ul de PBS supplémenté avec 0,02% de SAB par tube de réaction. Diluer la quantité appropriée de l'anticorps avec le volume respectif de PBS supplémenté avec 0,02% de BSA. Ajouter 50 pi d'anticorps secondaire dilué dans tous les tubes de réaction à l'exception du tube de réaction désigné pour le contrôle natif. Compléter le dernier avec 50 ul de PBS additionné de 0,02% de BSA. Tourbillonnaire tous les échantillons pendant quelques secondes. Incuber tous les échantillons pendant 30 minutes dans l'obscurité. Répétez l'étape deux fois 3.6. Ajouter 50 ul de PBS à chaque réaction tube vortex et analyser les échantillons sur un cytomètre de flux. 4. Analyse par cytométrie en flux Utilisation de la commande native, ajuster les paramètres suivants cytomètre pour optimiser l'analyse des données. En utilisant la diffusion vers l'avant (FSC) contrôleur de seuil affiché sur le panneau de commande de l'appareil, régler le seuil de FSC à la valeur la plus faible (200) et commencer l'analyse. En utilisant le régulateur de tension de dispersion, ajuster le FSC et scatter latéral (SSC) de cette façon que toutes les particules PM10 peuvent être détectées et que la population de particules est situé approximativement dans ee milieu de l'axe du FCS et dans la moitié inférieure de l'axe de PVC. En utilisant le régulateur de tension de fluorescence, régler la tension de l'APC et une autre tension de fluorescence comme isothiocyanate de fluorescéine (FITC), qui ne produit pas à la même longueur d'onde comme APC, le cas échéant. Assurez-vous que toutes les particules sont visibles dans la moitié inférieure des deux axes de fluorescence. Consécutivement, examiner chaque échantillon, y compris le contrôle natif et stocker les données FSC, SSC, APC et FITC d'au moins 10.000 particules par échantillon. Évaluer les données avec le logiciel respectif. teneur en allergène adsorbé spécifique dans l'échantillon peut être quantifiée de deux façons: Analyser l'intensité de fluorescence APC de toutes les particules (valeur médiane) en tant que mesure de Bet v 1 charge sur toutes les particules PM10. NOTE: Si l'échantillon spécifique contenait allergène, APC intensité de fluorescence devrait augmenter dans l'échantillon spécifique par rapport au témoin négatif. En revanche, d'autres Fluorintensités de escence (par exemple., FITC d'intensité de fluorescence) ne devrait pas changer de manière significative. Calculer le pourcentage de particules PM10 avec anti-Bet v 1 anticorps lié. Ainsi, dans le contrôle négatif, définir une grille autour des particules considérées APC positif, copier et coller cette porte dans l'échantillon spécifique et soustraire le pourcentage de particules positives APC dans le contrôle négatif du pourcentage de particules positives APC dans l'échantillon spécifique.