ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת חלקיקים טעונים האלרגן על ידי cytometry הזרימה. חלקיקי חומר חלקיקי הסביבה עלולים לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed. ונביא כאן כי cytometry זרימה, שיטה בשימוש נרחב כדי לאפיין מוצקים מרחפים> 0.5 מיקרומטר קוטר, ניתן להשתמש כדי למדוד חלקיקים אלרגנים טעונות אלו.
Abstract
Cytometry זרימה היא שיטה נפוצה לכמת מוצקים מרחפים כגון תאים או חיידקים במגוון בגודל מ 0.5 עד כמה עשרות מיקרומטר קוטר. בנוסף אפיון של מאפייני פיזור קדימה ולצדדים, היא מאפשרת את שימוש סמנים שכותרתו ניאון כמו נוגדנים לגילוי מבני בהתאמה. באמצעות מכתים נוגדן עקיף, cytometry זרימה מועסק כאן לכמת האלרגן אבקה לבנה (בית בדיוק v 1) -loaded חלקיקים של 0.5 עד 10 מיקרומטר בקוטר של חומר חלקיקי inhalable (PM10, החלקיקים בגודל ≤10 מיקרומטר קוטר). חלקיקי PM10 יכול לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed ואולי והובלתם אל דרכי הנשימה התחתונות, שבו יכלו לגרום לאלרגיה.
עד כה התוכן האלרגן של PM10 נחקרה באמצעות מבחני immunosorbent מקושר אנזים (ELISAs) במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. ELISA מודד את מומס ולא החלקיקהאלרגן -bound. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אשר יכול לדמיין חלקיקים טעונים האלרגן, cytometry זרימה ייתכן גם לכמת אותם. כתוכן האלרגן של אוויר הסביבה יכול לסטות ספירת אבקה לבנה, תופעות אלרגיות שאולי לתאם טוב יותר עם החשיפה לאלרגן מאשר עם ספירת אבקה. בשילוב עם נתונים קליניים, השיטה המוצגת מציעה את ההזדמנות כדי לבדוק בניסויים עתידיים אם תגובות אלרגיות ליבנת אנטיגנים אבקה המתקשרות לתוכן האלרגן בית V 1 של חלקיקי PM10> 0.5 מיקרומטר.
Introduction
זיהום אוויר נשקל בתור גורם סביבתי חשוב של השכיחות המוגברת וחומרת האלרגיות של דרך נשימה נצפו בעשורים האחרונים 1-3. כמו כן, חל העניין הגובר בחלוקת אלרגנים נפוצים 4,5 אבק.
אבקה ליבנה יכול לעורר קדחת השחת אבל גם יכול להוות טריגר חשוב של אסטמה אלרגית 6-8. אבקה לבנה כולה אינו צפוי להיכנס בדרכי הנשימה התחתונות או להימצא PM10 כתוצאה גודלו (22 מיקרומטר קוטר). עם זאת, אלרגנים אבקה לבנה כמו בית V 1, המרכיב העיקרי ליבנה אבקה האלרגן, יכול להשתחרר אחרי אבקה קרע 9 והוא יכול להיקשר חלקיקים באוויר הסביבה 10, ובכך אולי להיכנס דרכי הנשימה הנשימה התחתונות. ואכן, הוכח כי PM10 עשוי להכיל אלרגנים פעילים ביולוגית כפי שהוכח על ידי במבחנה ההפעלה של basophiles מתוך proband אבקה אלרגיות 11 </sup>.
בית V 1 תוכן האלרגן בדגימות PM10 נחקרה על ידי לחילוץ האלרגן בהתאמה וכימות הבאים עם ELISA 12-14. בעזרת טכניקת ELISA, האלרגן המומס נמדד, אבל כמות חלקיקים טעון האלרגן עדיין לא הייתה ידועה. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק גילה חלקיקים טעונים האלרגן, אך לא איפשרו כימות 10,15.
מחקר זה מעסיק cytometry זרימה לכמת את שיעור v בית 1 טעון חלקיקי PM10 בדגימות אוויר סביבה. בשל גבול הגילוי של cytometer את הזרימה רק חלקיקים גדולים יותר מ -0.5 מיקרומטר יכול להיבחן. > 0.5 מיקרומטר שבריר PM10 יכונה בהמשך כמו PM10> 0.5.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלב קריטי של הפרוטוקול הוא השימוש של מסנן מתאים לאיסוף חלקיקי PM10 מאוויר הסביבה (ראה שלב 1.1). המסנן צריך להיות חזק מספיק כדי לשאת את הצחצוח עם מברשת שיניים חשמלית, ולא כל חומרי הסינון למלא דרישה זו. הפרוטוקול המכתים הוקם עם ריכוז חלקיקי PM10 של 8×10 6 חלקיקים לכל מיליליטר. עם זאת, אם החומר הוא מוגבל ואיגום של דגימות אינו מתאים, השיטה כנראה תתפקד כמו גם, אבל ריכוזי הנוגדנים (רואים צעדים 3.5 ו -3.8) אולי צריך להיות מותאמים.
מכתים בית V 1 של חלקיקי PM10 לא לגרום אוכלוסיות נפרדות של חלקיקים מוכתמים לחיוב ולשלילה. זה עלול להיגרם על ידי כמויות משתנות של האלרגן בית V 1 שנספחו כל החלקיקים הנעים בין מעט מאוד עד לסכום גבוה. דבר זה עלול לגרום להרחבת האות APC ובכך להסיט את האוכלוסייה כלפיחיוביות APC. כמו שקשה להפריד את החיובי מן החלקיקים השליליים, שתי שיטות כימות שמשו כדי לקבוע את ההבדלים בתוכן בית V 1 של דגימות PM10> 0.5: (i) כימות יחסית על ידי מדידת עוצמת קרינת APC החציוני של כל החלקיקים , וכן (ii) קביעת אחוז חלקיקים חיוביים APC. לגבי העמסת בית V 1 של חלקיקים מן PM10 עונת אבקה נמוכה וגבוהה> 0.5, שתי השיטות חשפו תוצאות דומות. ובכל זאת, כימות יחסית על ידי עוצמת קרינה החציונית של כל החלקיקים מומלצות כפי שהוא אינו תלוי צבת השער ולכן כנראה פחות מועדות לטעויות.
עד כה מחקרים רבים לבדוק את תוכן האלרגן של חומר חלקיקי באוויר הסביבה על ידי לחילוץ האלרגן בהתאמה וכימות הבאים עם ELISA 5,12-14,17. יש הבדל מהותי בין ההליך המתואר כאן ואת quantification עם ELISA: ELISA מכמת את אנטיגן החילוץ המומס, cytometry הזרימה מנתח את אנטיגן מאוגד-החלקיק. באמצעות ELISA העומס בית V 1 של דגימות PM10 נבדק (n = 8) היה מתחת לגבול הגילוי של 1.2 ng / ml (מידע לא מוצג). באופן דומה, Buters ואחרים לא זיהו נ בית 1 PM <2.5 מיקרומטר שבריר ורק כ -7% ב -10 מיקרומטר> PM> 2.5 מיקרומטר שבר, אבל יותר מ -93% ב PM> 10 מיקרומטר שבריר באוויר הסביבה 13. התוצאות המנוגדות של ELISA מחד ועל הניתוח FACS מצד השני, עלולות להיגרם על ידי הבדלי שיטת זיהוי בשיתוף עם רגישות מסתעפת. מחקר נוסף עם זאת יש צורך באופן מלא להבין את ההבדל הזה.
שיטה לדמיין אנטיגן חלקיקים נכנסים הוא מיקרוסקופיית אלקטרונים 10,14. על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים, Ormstad et al. בית דמיינו V 1 על פני השטח של מט חלקיקי מרחףחלקיקי פיח r שנדגמו עונת האבקה הגבוהה ובמידה פחותה על חלקיקים שנדגמו עונת האבקה הנמוכה 15. בנוסף, אלרגנים מאבקני, לטקס וגם β-glucans נמצאו שנספחו חלקיקים בעירה באוויר הסביבה 10. שיטה זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת כימות של האלרגן כבול-החלקיק.
על ידי שימוש cytometry הזרימה, v בית נכנס חלקיקי האלרגן 1 יכול להיות לכימות. לפיכך, cytometry זרימה עשויה להציע דרך חדשה לאפיין 10 עד 0.5 מיקרומטר החלק הביולוגי של PM10 כמו עם נוגדנים מתאימים אחרים על יד, ששיטה זו עשויה להתארך עד זיהוי של אנטיגנים אחרים על חלקיקים באוויר סביבה, למשל, עובש, קרדית האבק אלרגנים או LPS. כחלקיקים PM10 לספוג לא חומר ביולוגי בלבד, אלא גם כימיקלים ומתכות די בקלות, מחייב נוקבים של נוגדנים יכול, לעומת זאת, מהווה בעיה. אם נוגדן חדש נבחן, צעד קריטי הוא להוכיח לאגד ספציפיing. ניתן לעשות זאת על ידי, למשל, חוסמת את קיבולת המחייב של הנוגדן הספציפי עם האנטיגן המקביל לפני מכתים 11.
כמו בית V 1 תוכן של אוויר הסביבה יכול להיות שונה ספירת אבקה לבנה 12,13,18, תופעות אלרגיות שאולי לתאם טוב יותר עם רמת האלרגנים מאשר עם אבקה לספור 14,18. לפיכך, השיטה המוצגת בשיתוף עם נתונים קליניים מאפשרת לבחון בניסויים עתידיים אם תגובות אלרגיות ליבנה מתאימות עומס האלרגן בית V 1 של PM10> 0.5.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.
Materials
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/h |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55mm, H 15mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1,4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
- Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?. J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
- Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
- Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
- Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
- Brough, H. A., et al. Distribution of peanut protein in the home environment. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).
- Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. The development of allergic inflammation. Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).
- World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. , 256 (2003).
- Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
- Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
- Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
- Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
- Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
- Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
- Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
- Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
- Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
- Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).
