PM10における粒子結合のBet V 1アレルゲンのフローサイトメトリー分析

注：このプロトコルは、ベットV 1、主要なカバノキ花粉抗原成分に加え、アロフィコシアニン（APC）に対するモノクローナル抗体（モノクローナルマウスIgG1抗体、クローンMA-3B4）とのPM10粒子の間接的な染色を記述するには、二次抗体を標識（抗-mouse IgG1抗体、クローンA85-1）とフローサイトメーター上でその後の分析。使用可能な適切な他の抗体を用いて、この方法は、周囲の空気粒子に結合した他の抗原の検出に拡張されるかもしれません。 1. PM10サンプリングポリテトラフルオロエチレン（PTFE）に対する周囲の空気からPM10を集めては、2.3メートル3 /時（ 図1）の流量で低容量サンプラーを使用してフィルタリングします。ここに記載される実験のために使用さサンプラーの特徴16に見出されます。時間を実行すると、必要なPM10の量（通常は1〜10日）に依存します。 インキュベーション時間の終わりに、サンプラーからフィルタを削除し、でそれを凍結-20°Cまで使用。 図1.低ボリュームPM10サンプラー。低容量PM10サンプラーの例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 2. PM10の取り外しおよび粒子数約5分間のPTFEフィルター解凍しましょう。その後、きれいなポリスチロールペトリ皿（ 図2A）にフィルターを置きます。複数のフィルタが処理される場合、各フィルタのための新たなペトリ皿を取ります。 その後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でのPTFEフィルターを重ねます。このプロトコルは、1ml当たり8×10 6粒子の最終PM10濃度のために確立されている（ステップ3.3を参照）。少なくともその濃度を得るために、とフィルターをオーバーレイするPBSの次の実験ボリュームを使用：PM10収集時間があった場合< 2日、2ミリリットルを使用します。インキュベーション時間≥2日間、4ミリリットルを使用します。 注：これは、適切である場合、PM10懸濁液の粒子濃度を増加させるために、異なるフィルタの懸濁液を、プールすることができます。 1分間に敏感なブラシヘッド（ 図2B、2C）と電気歯ブラシでピンセットとブラシとのPTFEフィルターを保持します。粒子-PBS-サスペンションを移し、以後は、クリーンな反応管に、PM10サスペンションと呼ばれます。 電動歯ブラシと 図2 PM10除去。サンプリングPM10とポリテトラフルオロエチレンフィルターはポリスチロールペトリ皿（A）内に配置されているし、4 mlのPBSを重層します。そして、PM10は、電動歯ブラシで除去される（B：1分間のブラッシング後：ブラッシングとCの前に）。= "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 パーティクルカウンタを用いて、例えば、PM10粒子の濃度を測定します。 、このような10ミリリットル中に50μlの等張性測定用緩衝液としてPM10懸濁液の十分な量を希釈3回測定し、1ml当たりの粒子の平均合計数を計算します。関連するサイズの粒子を検出することができるパーティクルカウンタを使用してください。 3.ベットV 1染色試料の分析のために必要な反応管の数を計算します。少なくとも3つの反応管が必要とされている：（ⅰ）サンプルのみ（ネイティブコントロール）と一本のチューブのサンプルを加えた二次抗体（陰性対照）と（ii）1つの管、および（ ⅲ）サンプルを加えた一次および二次抗体と1のチューブ（特定のサンプル）。最初に測定された場合には、（II）（I）は、少なくとも二つの反応チューブを調製し、および（iii）適切に設定する（ステップ4.1参照）サイトメーターを調整するのに十分な材料を持っています。 反応管の数に必要なPM10懸濁液の量を計算します。各反応管は、懸濁液の50μlのを必要とします。 PBSの適切な量を追加することで、1ml当たり8×10 6粒子の最終濃度になるようにステップ3.2で算出された懸濁液の容量のためのステップ2.4で測定された粒子濃度を調整します。 注：このプロトコルのために新たに調製したPM10サスペンションが推奨されているが、残りのPM10懸濁液は、将来の実験のために-20℃で凍結することができます。 ブロックなどの1％BSAをPBSで調製したストック溶液を用いて、0.02％の最終濃度でウシ血清アルブミン（BSA）でPM10懸濁液を補充することによって非特異的結合。簡単にボルテックスし、室温で20分間インキュベートします。 各サンプルは、フローサイトメトリーによって分析するために、交流のステップ3.4からの懸濁液の50μLを移しますリーン反応管。簡潔に特異的染色、渦のために指定された反応管に0.02μgの/μlの最終濃度でのBet V 1に対するモノクローナルマウス抗体を加え、室温で60分間インキュベートします。 ネイティブコントロールとネガティブコントロールはまた、室温で60分間滞在のために指定PM10-BSA懸濁液と反応チューブをしてみましょう。 500μlのPBSを添加することによって、すべてのサンプルを洗浄が簡単に、各反応管に0.02％BSAで渦を補充し、室温で5分間、4,700×gで、その後、サンプルを遠心分離します。真空ポンプを使用して、慎重に上清を捨てます。 繰り返し手順3.6。 必要に応じてAPC標識二次抗マウスIgG1抗体の総量を決定する：50μlのPBSに溶解した1μgの抗体が反応チューブあたり0.02％BSAを補充しました。 0.02％BSAを補充したPBSのそれぞれの体積を有する抗体の適切な量を希釈します。 ネイティブコントロールに指定された反応管を除くすべての反応チューブに希釈した二次抗体を50μl加えます。 PBSは、0.02％BSAを補充した50μlの後者を補います。数秒間ボルテックスは、すべてのサンプル。 暗所で30分間、すべてのサンプルをインキュベートします。 二回ステップ3.6を繰り返します。 各反応チューブ、ボルテックスに50μlのPBSを加え、フローサイトメーター上で試料を分析します。 4.フローサイトメトリー分析ネイティブコントロールを使用して、データ分析を最適化するためのパラメータサイトメーター以下を調整します。 デバイスコントロールボードに表示前方散乱（FSC）閾値制御回路を使用することにより、最低値（200）にFSCのしきい値を設定し、分析を開始します。 散乱電圧制御を使用して、すべてのPM10粒子を検出することができるそのようにFSCおよび側方散乱（SSC）を調整し、粒子の集団は、目にほぼ位置していること電子のFSC軸の中央およびSSCの軸の下半分インチ蛍光の電圧制御を使用して、APC電圧と、必要に応じて、APCのような同一の波長で発光しないフルオレセインイソチオシアネート（FITC）のような他の蛍光の電圧を調整します。全ての粒子が両方の蛍光軸の下半分に表示されていることを、確認してください。 連続して、ネイティブの制御を含む各サンプルを検査し、サンプルあたり10,000以上の粒子のFSC、SSC、APC、およびFITCデータを格納します。 それぞれのソフトウェアを使用してデータを評価します。特定のサンプルに吸着アレルゲン含量は、2つの方法で定量化することができます。 すべてのPM10粒子の上にあるBet V 1負荷の指標として全粒子（中央値）のAPCの蛍光強度を分析します。 注：特定のサンプルは、アレルゲンが含まれている場合は、APCの蛍光強度は、陰性対照と比較して、特定のサンプルに増やす必要があります。対照的に、他のフッ素escence強度（ 例えば 、FITCの蛍光強度）が大幅に変更すべきではありません。 結合した抗ベットV 1抗体でPM10粒子の割合を計算します。これにより、負の制御では、APCが陽性とみなさ粒子の周囲ゲートを設定し、特定のサンプルにこのゲートをコピーして貼り付け、特定のサンプル中のAPCの正の粒子の割合からの負の制御にAPC正の粒子の割合を差し引きます。