Análisis de citometría de flujo de partículas unida a Bet v 1 de alérgenos en el MP10

NOTA: Este protocolo describe la tinción indirecta de partículas PM10 con un anticuerpo monoclonal (anticuerpo IgG1 monoclonal de ratón, clon MA-3B4) contra Bet v 1, el componente antígeno principal del polen de abedul, además de una aloficocianina (APC) marcada con anticuerpo secundario (anti anticuerpo -Ratón IgG1, clon A85-1) y la posterior análisis en un citómetro de flujo. Con otros anticuerpos adecuados disponibles, este método podría extenderse a la detección de otros antígenos unidos a las partículas en el aire ambiente. 1. El muestreo de PM10 Recoger PM10 del aire ambiente en politetrafluoroetileno (PTFE) filtros usando un muestreador de bajo volumen con un caudal de 2,3 m3 / h (Figura 1). Una caracterización del sistema de muestreo utilizado para los experimentos descritos aquí se encuentra en el 16. Tiempo de funcionamiento depende de la cantidad de PM10 necesario (por lo general entre 1 y 10 días). Al final del tiempo de incubación, retirar el filtro de la toma de muestras y congelarlo en-20 ° C hasta su uso. Figura 1. Bajo muestras de volumen de PM10. Ejemplo de un muestreador de bajo volumen de PM10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La eliminación 2. PM10 y recuento de partículas Deje que el deshielo del filtro de PTFE durante unos 5 minutos. Luego, se coloca el filtro en una placa de Petri de poliestireno limpia (Figura 2A). Tome una nueva placa de Petri para cada filtro, si se procesa más de un filtro. Posteriormente, superponer el filtro de PTFE con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se establece este protocolo para una concentración de PM10 final del 8×10 6 partículas por ml (véase el paso 3.3). Para obtener al menos esa concentración, utilice el siguiente volumen empírica de PBS para superponer el filtro con: Si el tiempo de recogida de PM10 fue < 2 días, utilizan 2 ml. Para los tiempos de incubación ≥ 2 días, use 4 ml. NOTA: Con el fin de aumentar la concentración de partículas de la suspensión PM10, suspensiones de diferentes filtros pueden ser agrupados, si es apropiado. Mantenga el filtro de PTFE con pinzas y cepillo con un cepillo de dientes eléctrico con una sensible cabeza del cepillo durante 1 minuto (Figuras 2B, 2C). Transferir la partícula-PBS-suspensión, suspensión PM10 en adelante denominado, a un tubo de reacción de limpieza. Figura 2. eliminación PM10 con un cepillo de dientes eléctrico. Un filtro de politetrafluoroetileno con PM10 muestreada se coloca en un plato Petri de poliestireno (A) y se superpone con 4 ml de PBS. Entonces, PM10 se quita con un cepillo de dientes eléctrico (B: antes de cepillar y C: después del cepillado durante 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Medir la concentración de partículas PM10, por ejemplo, mediante el uso de un contador de partículas. Diluir un volumen adecuado de PM10 suspensión tales como 50 l en 10 ml de tampón de medición isotónica, medir tres veces y calcular el número total medio de partículas por ml. Asegúrese de utilizar un contador de partículas que puede detectar partículas del tamaño correspondiente. 3. Bet v 1 tinción Calcular el número de tubos de reacción requeridos para el análisis de la muestra: Al menos tres son necesarios tubos de reacción: (i) un tubo con única muestra (control nativo) (ii) un tubo con la muestra más el anticuerpo secundario (control negativo), y ( iii) un tubo con la muestra más el anticuerpo primario y secundario (muestra específica). Si se mide por primera vez, preparar al menos dos tubos de reacción de (i) (ii),y (iii) que tiene material suficiente para ajustar adecuadamente citómetro de configuración (véase el paso 4.1). Calcular la cantidad de suspensión PM10 necesario para el número de tubos de reacción. Cada tubo de reacción requiere 50 l de suspensión. Ajustar la concentración de partícula medido en el paso 2.4 para el volumen de suspensión calculado en la etapa 3.2 a una concentración final de 8×10 6 partículas por ml mediante la adición de una cantidad apropiada de PBS. NOTA: La suspensión PM10 restante puede congelarse a -20 ° C para futuros experimentos, aunque para este protocolo recién se recomienda suspensión PM10 preparado. Bloquear la unión inespecífica por que complementa la suspensión PM10 con albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración final de 0,02%, utilizando una solución madre tal como 1% de BSA preparado con PBS. Vortex brevemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Para cada muestra a analizar por citometría de flujo, la transferencia de 50 l de la suspensión de la etapa 3.4 para actubo de reacción magra. Añadir un anticuerpo de ratón monoclonal contra Bet v 1 a una concentración final de 0,02 mg / l a los tubos de reacción designadas para la tinción específica, vórtice brevemente y se incuba durante 60 min a temperatura ambiente. Dejar que los tubos de reacción, la suspensión PM10-BSA designado para el control natal y el control negativo también se mantienen durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lavar todas las muestras mediante la adición de 500 l de PBS suplementado con 0,02% de BSA a cada tubo de reacción, brevemente vortex y centrifugar las muestras a continuación a 4700 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante con cuidado utilizando una bomba de vacío. Repita el paso 3.6. Determine la cantidad total de anticuerpo anti-IgG1 de ratón secundario marcado con APC necesario: 1 mg de anticuerpo disuelto en 50 l de PBS suplementado con 0,02% de BSA por tubo de reacción. Diluir la cantidad apropiada de anticuerpo con el volumen respectivo de PBS suplementado con 0,02% de BSA. Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a todos los tubos de reacción, excepto para el tubo de reacción designado para el control natal. Suplemento este último con 50 l de PBS suplementado con 0,02% de BSA. Vortex todas las muestras durante unos segundos. Incubar todas las muestras durante 30 min en la oscuridad. Repita el paso 3.6 en dos ocasiones. Añadir 50 l de PBS a cada reacción tubo, vórtice y analizar las muestras en un citómetro de flujo. 4. Análisis de citometría de flujo Uso del control natal, ajuste los siguientes parámetros para optimizar el citómetro de análisis de datos. Al utilizar el controlador de umbral de dispersión frontal (FSC) que aparece en el tablero de control del dispositivo, establecer el umbral de FSC en el valor más bajo (200) e iniciar el análisis. Al utilizar el controlador de voltaje de dispersión, ajustar el FSC y la dispersión lateral (SSC) de esa manera que todas las partículas PM10 pueden ser detectados y que la población de partículas se encuentra aproximadamente en THe mitad del eje del FSC y en la mitad inferior del eje SSC. Al utilizar el controlador de tensión de fluorescencia, ajustar el voltaje de APC y otra tensión de fluorescencia como isotiocianato de fluoresceína (FITC), que no emite en la misma longitud de onda como APC, si es necesario. Asegúrese de que todas las partículas son visibles en la mitad inferior de los dos ejes de fluorescencia. Consecutivamente, examinar cada muestra, incluyendo el control natal y almacenar los datos de FSC, SSC, APC, y FITC de al menos 10.000 partículas por muestra. Evaluar los datos con el software correspondiente. el contenido de alérgenos adsorbidos en la muestra específica se puede cuantificar de dos maneras: Analizar la intensidad de fluorescencia de APC de todas las partículas (valor medio) como una medida de Bet v 1 carga sobre todas las partículas PM10. NOTA: Si la muestra específica contenida alergeno, la intensidad de fluorescencia de APC debe aumentar en la muestra específica en comparación con el control negativo. En contraste, otros fluorintensidades Escence (por ejemplo., FITC intensidad de fluorescencia) no deben cambiar de manera significativa. Calcular el porcentaje de partículas PM10 con cota anti-Bet v 1 anticuerpo. De este modo, en el control negativo, establecer una puerta alrededor de las partículas consideradas APC positivo, copiar y pegar esta puerta en la muestra específica y restar el porcentaje de partículas de APC positivos en el control negativo a partir del porcentaje de partículas de APC positivos en la muestra específica.