PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석
Summary
여기서는 유동 세포 계측법에 의해 알레르겐 – 로딩 입자를 정량 할 수있는 프로토콜을 제시한다. 주변 미립 입자 흡착 알레르겐의 담체로서 작용할 수있다. 우리는 유동 세포 계측법, 방법은 널리 직경이 0.5㎛가 이러한 알레르겐 – 로딩 입자를 측정 할 수있다> 부유 물질을 특성화하는 데 사용 여기 나타낸다.
Abstract
유동 세포 계측법은 널리 0.5 직경 수십 ㎛을 크기 범위에있는 세포 또는 박테리아 등의 현탁 물질을 정량화하기 위해 사용하는 방법이다. 전방 및 측방 산란 특성의 특성에 더하여, 그 각 구성을 검출하기 위해 항체와 같은 형광 표지 마커의 사용을 가능하게한다. 간접 항체 염색법을 사용하여, 자작 나무 꽃가루 알레르기를 정량화하기 위해 세포 계측법 여기에 사용된다 흐름 흡입 입자상 물질 (PM10, 입자 크기 직경이 ≤10 μm의)에 직경 0.5 μm의 10의 입자를 -loaded (정확하게 1 절 내기). 흡착 알러지 유발 물질의 운반 가능성이 그들이 알레르기 반응을 트리거 할 수있는 하부 호흡기, 그들을 수송으로 PM10 입자 작용할 수있다.
지금까지 PM10의 알레르겐의 함량은 효소 결합 면역 분석법 (ELISA를) 주사 전자 현미경을 이용하여 연구되었다. ELISA는 입자를 용해하지 측정-bound 알레르겐. 알레르겐 – 로딩 입자를 시각화 별도로이를 정량화 할 수있다 유세포 수 사형 전자 현미경에 비해. 주변 공기의 알레르기 항원 함량은 자작 나무 꽃가루 카운트에서 벗어날 수 있듯이, 알레르기 증상은 아마도 꽃가루 개수보다 알레르겐 노출 더 상관 관계가 있습니다. 임상 데이터와 함께, 제시된 방법은 알레르기 반응 꽃가루 항원이 PM10 입자> 0.5 μm의의 베팅 1 절 알레르기 콘텐츠와 관련된 자작 나무할지 여부를 미래의 실험에서 테스트 할 수있는 기회를 제공합니다.
Introduction
대기 오염은 최근 수십 년간 1-3에서 관찰 호흡기 알레르기의 증가 빈도와 심각도의 중요한 환경 적 원인으로 간주되고있다. 또한, 먼지 4,5 일반적인 알러지 유발 물질의 분포에 대한 관심이 있었다.
자작 나무 꽃가루는 꽃가루 알레르기를 유발 할 수 있습니다뿐만 아니라 알레르기 성 천식 6-8의 중요한 트리거 할 수 있습니다. 항목 자작 나무 꽃가루 하부 호흡기를 입력 또는 크기 (직경 22 μm의)의 결과로서 PM10에서 발견 될 가능성이 없다. 그러나 베팅 1 절, 주요 자작 나무 꽃가루 알레르기 성분, 같은 자작 나무 꽃가루 알레르기는 꽃가루 파열 구 이후에 출시 될 수 있으며, 하부 호흡기기도를 따라서 가능, 대기 입자 (10)에 결합 입력 할 수 있습니다. 실제로,이 꽃가루 알레르기 proband (11) basophiles의 체외 활성화에 의해 입증 된 바와 같이 PM10은 생물학적 활성 알레르기가있는 것으로 나타났다 </suP>.
PM10 샘플에 베팅 1 절 알레르기 항원 함량은 ELISA 12-14로 각각의 알레르겐과 이후의 정량화를 추출하여 연구되어왔다. ELISA 법으로 용해 알레르겐을 측정했지만, 알레르겐 – 로딩 된 입자의 양이 아직 알려지지. 주사 전자 현미경은 알레르기로드 입자를 밝혀 있지만, 정량 10, 15를 허용하지 않았다.
이 연구는 주변 공기 샘플에 베팅 1 절로드 PM10 입자의 비율을 정량화하는 유동 세포 계측법 사용한다. 유량의 검출 한계로 인해뿐만 초과 0.5 μm의 조사가 가능 입자 사이토. PM10의> 0.5 μm의 비율은 더 PM10으로> 0.5로 언급 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 중요한 단계는 대기에서 PM10 입자의 수집을위한 적절한 필터를 사용하는 것이다 (단계 1.1 참조). 필터는 전기 칫솔 칫솔질 견딜만큼 튼튼해야하고, 모든 필터 재료는 이러한 요건을 충족. 염색 프로토콜 ml의 당 8×10과 6 입자의 PM10 입자 농도가 설립되었다. 재료가 제한되고 샘플 풀링 적절하지 그러나 경우, 메소드는 아마 잘 작동되지만, 항체 농도가 조절 될 수있다 (단계 3.5 및 3.8 참조).
PM10 입자의 베팅 1 절 염색 긍정적 및 부정적 스테인드 입자의 별개의 집단 발생하지 않았다. 이것은 최대 아주 작은에서 많은 양에 이르기까지 입자의 각 흡착 내기 V 1 알레르기 항원의 다양한 양의에 의해 발생 될 수 있습니다. 이는 따라서 인구를 향해 시프트 APC 신호의 확장을 초래할 수APC 양성. 모든 입자의 평균 APC 형광 강도를 측정하여 (I)의 상대적인 정량 : 그것은 음의 입자의 양을 분리하는 것이 곤란하기 때문에, 두 개의 정량 방법은 PM10> 0.5 시험편 배팅 V 한 내용의 차이를 결정하기 위해 사용 된 및 (ⅱ) APC 대상 입자의 비율을 결정하는 단계를 포함한다. 저 높은 꽃가루 시즌 PM10> 0.5 입자의 베팅 1 절 부하에 대해서는 두 방법 모두 비슷한 결과를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이 때문에 게이트를 배치의 독립과 같이 아직도, 모든 입자의 평균 형광 강도에 의해 상대 정량을 권장 아마 덜 오류가 발생하기 쉬운.
지금까지 많은 연구 ELISA 5,12-14,17와 각각의 알레르겐과 이후의 정량화를 추출하여 대기 입자상 물질의 알레르기 항원 함량을 검사합니다. 여기에 기술 된 절차와 quantificatio 간의 기본적인 차이가N ELISA에 : 유동 세포 계측법은 입자 – 결합 된 항원을 분석하면서 ELISA는 추출 용해 항원 정량화. ELISA를 통해 테스트 PM10 샘플의 BET V 1 부하 (N = 8) 1.2 ng를 / ㎖의 검출 한계 미만이었다 (데이터는 보이지 않음). 마찬가지로, Buters 등은 PM <2.5 μm의 분수와 10 μm의에서 약 7 %> PM> 2.5 μm의 일부지만, PM 대기 13> 10 μm의 비율에 93 % 이상에 더 베팅 1 절을 확인하지 않습니다. 한편, 다른 한편으로는 FACS 분석에 대한 ELISA의 대조 결과를 발산 감도와 결합 검출 방법의 차이에 의해 야기 될 수있다. 또한 연구 그러나 완전히 차이를 이해하는데 필요하다.
방법은 입자 – 결합 항원은 전자 현미경을 스캔 10,14 시각화된다. 전자 현미경을 스캔하여, Ormstad 외. 부유 입자 매트의 표면 상에 가시 내기 V 1r에 매연 입자는 높은 꽃가루 시즌과 낮은 꽃가루 시즌 15 샘플 입자에 조금 적게 샘플링. 또한, 화분, 라텍스, 또한 β 글루칸에서 알레르겐은 대기 (10)에서 연소 된 입자에 흡착되는 것으로 밝혀졌다. 그러나,이 방법은 입자 – 결합 항원의 정량화를 허용하지 않는다.
유동 세포 계측법을 사용하여, 입자 결합 내기 1 절 알러지 유발 물질은 정량 할 수있다. 따라서, 한편으로 다른 적절한 항체로 PM10의 10-0.5 μm의 생물학적 부분을 특성화하는 새로운 방법을 제공 할 수 유세포,이 방법은 대기 입자, 예를 들면, 곰팡이, 진드기의 다른 항원의 검출로 확장 될 수도 알레르기 또는 LPS. PM10 입자를 아주 쉽게 또한 화학 및 금속뿐만 아니라 생체 물질을 흡착하지만 같이, 항체의 비특이적 결합하지만, 문제를 제기 할 수있다. 새로운 항체를 시험하는 경우 중요한 단계는 특정 바인딩을 증명하는 것이다ING. 이것은 11 염색 전에 대응하는 항원과 특이 적 항체의 결합을 차단하는 능력, 예를 들어, 수행 될 수있다.
14, 18를 계산 내기 V로 주변 공기의 한 내용이 자작 나무 꽃가루 수 12,13,18과 다를 수 있습니다, 알레르기 증상은 아마도 꽃가루보다 알레르기 수준이 더 상관 관계가 있습니다. 따라서, 임상 데이터와 함께 제시된 방법은 자작 나무에 알레르기 반응이 PM10> 0.5의 베팅 1 절 알레르겐 부하에 해당하는지 여부 미래의 실험에서 검사 할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.
Materials
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/h |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55mm, H 15mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1,4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
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