Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Opmerking: Dit protocol beschrijft de indirecte kleuring van PM10 met een monoklonaal antilichaam (monoklonaal muizen IgG1 antilichaam kloon 3B4-MA) tegen Bet v 1, grote berkenpollen antigeencomponent, plus een allofycocyanine (APC) gemerkt secundair antilichaam (anti -mouse IgG1 antilichaam, kloon A85-1) en de daaropvolgende analyse op een flowcytometer. Met geschikte andere antilichamen beschikbaar zijn, kan deze werkwijze worden uitgebreid tot de detectie van andere antigenen gebonden aan omgevingslucht deeltjes. 1. PM10 Sampling PM10 verzamelen van lucht met polytetrafluorethyleen (PTFE) filters met een laag volume sampler met een stroomsnelheid van 2,3 m 3 / uur (figuur 1). Een karakterisering van de sampler toegepast voor de hier beschreven experimenten is gevonden in 16. Looptijd afhankelijk is van de hoeveelheid die nodig PM10 (meestal tussen 1 en 10 dagen). Aan het einde van de incubatietijd, verwijder het filter uit de sampler en bevriezen bij-20 ° C tot gebruik. Figuur 1. Lage volume PM10 sampler. Voorbeeld van een laag volume PM10 sampler. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. PM10 verwijderen en Particle Count Laat de PTFE filter dooi gedurende ongeveer 5 minuten. Vervolgens zet de filter in een schone polystyreen petrischaal (Figuur 2A). Neem een ​​nieuwe petrischaal voor elk filter, indien meer dan één filter verwerkt. Vervolgens bedekken de PTFE filter met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Dit protocol is opgesteld voor een laatste PM10-concentratie van 8×10 6 deeltjes per ml (zie stap 3.3). Voor het verkrijgen van tenminste dat concentratie, gebruik dan de volgende empirische volume van PBS om het filter overlay met: Als de PM10-collectie keer was < 2 dagen, gebruik maken van 2 ml. Voor incubatietijden ≥2 dagen, gebruik maken van 4 ml. Opmerking: Om de deeltjesconcentratie van de PM10 suspensie verhogen, kunnen suspensies van verschillende filters worden samengevoegd, indien dit wenselijk is. Houd het PTFE filter met een pincet en bestrijk ze met een elektrische tandenborstel met een gevoelige opzetborstel voor 1 min (Figuren 2B, 2C). Transfer het deeltje-PBS-ophanging, hierna aangeduid als PM10 schorsing, een schone reageerbuis. Figuur 2. PM10 verwijdering van een elektrische tandenborstel. Een polytetrafluoretheen filter met PM10 bemonsterd wordt in een petrischaal polystyrol (A) en is bedekt met 4 ml PBS. Vervolgens PM10 wordt verwijderd met een elektrische tandenborstel (B: voor borstelen en C: na het poetsen gedurende 1 min).= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Meet de concentratie van PM10, bijvoorbeeld door toepassing van een deeltjesteller. Verdun een toereikende hoeveelheid PM10 suspensie zoals 50 ul in 10 ml isotone buffer meten, meet drie keer en berekent het gemiddelde totale aantal deeltjes per ml. Zorg ervoor dat u een deeltje teller die deeltjes van het betreffende formaat kan detecteren gebruiken. 3. Bet v 1 kleuring Bereken het aantal reactiebuizen voor de analyse van het monster ten minste drie reageerbuisjes nodig: (i) een buis met alleen monster (natief controle) (ii) een cuvet met plus secundair antilichaam (negatieve controle), en ( iii) één buis met het monster plus primaire en secundaire antilichaam (specifiek monster). Gemeten voor het eerst bereiden tenminste twee reactiebuizen voor (i) (ii),en (iii) voldoende materiaal goed aan te passen cytometer instellingen (zie stap 4,1). Bereken de hoeveelheid PM10 suspensie vereist voor het aantal reactiebuizen. Elke reactie buis moet 50 ul van de opschorting. Stel de deeltjesconcentratie gemeten in stap 2,4 voor de hoeveelheid suspensie in stap 3,2, berekend tot een uiteindelijke concentratie van 8×10 6 deeltjes per ml door toevoeging van een geschikte hoeveelheid PBS. OPMERKING: De resterende PM10 suspensie kan worden ingevroren bij -20 ° C voor latere experimenten, hoewel voor dit protocol PM10 vers bereide suspensie wordt aanbevolen. Blok aspecifieke binding door daaraan PM10 suspensie met runderserumalbumine (BSA) bij een uiteindelijke concentratie van 0,02%, onder toepassing van een voorraadoplossing zoals 1% BSA bereid met PBS. Kort vortexen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voor elk monster cytometrie geanalyseerd door flow, overdracht 50 ul van de suspensie van stap 3,4 tot aclean reactie buis. Voeg een monoklonaal muizenantilichaam tegen Bet v 1 in een eindconcentratie van 0,02 ug / ul voor de aangegeven specifieke kleuring, kort vortexen reactiebuizen en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Laat de reactiebuizen met de PM10-BSA suspensie die voor de natieve controle en de negatieve controle ook blijven 60 minuten bij kamertemperatuur. Was alle monsters door toevoeging van 500 pi PBS aangevuld met 0,02% BSA aan elke reactiebuis, kort vortexen en centrifugeer de monsters vervolgens bij 4700 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een vacuümpomp. Herhaal stap 3.6. Bepaal de totale hoeveelheid APC-gelabeld secundair anti-muis IgG1 antilichaam nodig: 1 ug antilichaam opgelost in 50 pl PBS aangevuld met 0,02% BSA per reactiebuis. Verdun de juiste hoeveelheid antilichaam met het respectieve volume PBS aangevuld met 0,02% BSA. Voeg 50 pl verdund secundair antilichaam alle reactiebuizen behalve de voor de natieve controle reactiebuis. Vul het laatste met 50 pl PBS aangevuld met 0,02% BSA. Vortex alle monsters gedurende een paar seconden. Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten in het donker. Herhaal stap 3.6 twee keer. Voeg 50 ul PBS aan elke reactiebuis, vortex en de monsters op een stroom cytometer geanalyseerd. 4. Flow cytometrische analyse Met behulp van de inheemse controle, pas de volgende cytometer parameters om data-analyse te optimaliseren. Door het gebruik van de voorwaartse verstrooiing (FSC) drempel controller weergegeven op het apparaat besturingskaart, stelt de FSC drempel voor de laagste waarde (200) en start de analyse. Door het gebruik van de scatter spanning controller, stel de FSC en zijwaartse verstrooiing (SSC) op die manier dat alle PM10-deeltjes kunnen worden opgespoord en dat de bevolking van deeltjes ligt ongeveer in the midden van de FSC-as en in de onderste helft van het SSC as. Via de fluorescentie spanningsregelaar, stel de APC spanning en een spanning fluorescentie zoals fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), wat niet uitzendt op dezelfde golflengte als APC, indien nodig. Zorg ervoor, dat alle deeltjes zichtbaar in de onderste helft van een fluorescentie assen. Achtereenvolgens onderzoekt elk monster inclusief de natieve controle en bewaar de FSC, SSC, APC, en FITC-gegevens van ten minste 10.000 deeltjes per monster. Evalueer de gegevens met de desbetreffende software. Geadsorbeerd allergeen-gehalte in het specifieke monster kan worden gekwantificeerd op twee manieren: Analyseer de APC fluorescentie-intensiteit van alle deeltjes (mediane waarde) als maat voor Bet v 1 belasting over alle PM10. LET OP: Als de specifieke steekproef bevatte allergeen, moet APC fluorescentie-intensiteit in de specifieke monster te verhogen in vergelijking met de negatieve controle. Daarentegen, andere fluorescence intensiteiten (bijv., FITC fluorescentie-intensiteit) niet significant veranderen. Bereken het percentage van de PM10-deeltjes met gebonden anti-Bet v 1 antilichaam. Daarbij, in de negatieve controle, stel dan een hek rondom de deeltjes beschouwd APC positief, kopieer en plak deze poort in de specifieke monster en af ​​te trekken van het percentage van APC positieve deeltjes in de negatieve controle van het percentage van APC positieve deeltjes in het specifieke monster.