Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
La barriera emato-encefalica separa la circolazione sistemica del sistema nervoso centrale (CNS) 1 – 3. Esso fornisce una barriera fisica che inibisce la libera circolazione delle cellule e la diffusione delle molecole idrosolubili e protegge il cervello da agenti patogeni e sostanze potenzialmente nocive. Oltre alla sua funzione di barriera, la BBB consente la fornitura di ossigeno e nutrienti al parenchima cerebrale, che garantisce il corretto funzionamento del tessuto neuronale. Proprietà funzionali del BBB sono altamente regolamentati dai suoi componenti cellulari e acellulari, con EC altamente specializzato essendo il suo elemento strutturale principale. EC della BBB sono caratterizzati dalla presenza di giunzioni strette (TJ) complessi, la mancanza di finestrature, estremamente bassa attività pinocytic, e meccanismi di trasporto permanentemente attivi. Altri componenti della BBB membrana basale CE, periciti incorporamento l'endotelio, i piedi di fascia astrocitari e = par associatienchymal membrana basale contribuiscono allo sviluppo, la manutenzione e la funzione della BBB 2,4 – 6 e, insieme con i neuroni e microglia, formano l'unità neurovascolare (NVU), che permette il corretto funzionamento del CNS 7 – 9.
In una varietà di malattie neurologiche, come neurodegenerative, malattie infiammatorie o infettive, la funzione della BBB è compromessa 2,5,10. Disregolazione di TJ complessi e meccanismi di trasporto molecolari porta ad un aumento della permeabilità BBB, leucociti stravaso, infiammazione e danno neuronale. Al fine di studiare le proprietà di BBB in tali condizioni fisiopatologiche, vari modelli BBB in vitro sono stati stabiliti 9,11,12. Insieme hanno fornito preziose informazioni sui cambiamenti di integrità della barriera, la permeabilità così come meccanismi di trasporto. Questi modelli utilizzano cellule endoteliali di umano, topo, ratto, suina o bovina 13 – 18; cellule endoteliali primarie o linee cellulari sono coltivate sia come monocoltura o insieme con periciti e / o astrociti in modo da imitare più da vicino la BBB in vivo 19 SpA – 25. Negli ultimi anni, la misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) è diventato uno strumento ampiamente accettata per valutare le proprietà barriera endoteliale 26,27.
TEER riflette l'impedenza al flusso di ioni attraverso il monostrato cellulare e la sua diminuzione fornisce una misura sensibile compromissione dell'integrità barriera endoteliale e quindi aumento della permeabilità. Sono stati sviluppati diversi sistemi di misurazione Teer, tra cui epiteliale Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato elettrico impedenza di rivelazione (ECIS), e l'analisi delle cellule in tempo reale 15,28 – 30. TEER riflette la resistenza al flusso di ioni tra EC adiacenti (percorso paracellulare) ed è direttamente proporzionale allaintegrità della barriera. In spettroscopia di impedenza 27,31, impedenza totale complesso (Z) è misurata, che fornisce ulteriori informazioni sulla integrità della barriera misurando Ccl. Ccl riferisce alla corrente capacitiva attraverso la membrana cellulare (percorso transcellulare): lo strato di cellule agisce come un condensatore nel circuito elettrico equivalente, separando le cariche su entrambi i lati della membrana ed è inversamente proporzionale alla integrità della barriera. Quando coltivate su inserti permeabili, EC aderire, proliferano e si sviluppa su la membrana microporosa. Questa resiste alla corrente capacitiva sfondo dell'inserto (che si comporta come un condensatore) e porta ad una diminuzione della capacità fino a raggiungere il livello minimo. Questo è seguito dalla istituzione di TJ complessi che sigillare lo spazio tra EC adiacenti. Questo limita il flusso di ioni attraverso il percorso paracellulare, e TEER aumenta fino a raggiungere il plateau. In condizioni infiammatorie, tuttavia, il endotheliAl barriera è compromessa: TEER diminuisce come complessi TJ ottenere perturbato e Ccl aumenta la componente capacitiva dell'inserto sale nuovamente.
La nostra misura TEER utilizza il sistema automatizzato di monitoraggio cella 32: segue il principio della spettroscopia di impedenza ed estende le sue applicazioni precedenti. Qui, descriviamo un modello in vitro BBB che consente lo studio delle proprietà barriera, compresa l'interazione di endotelio cervello con cellule immunitarie; in particolare le cellule T attivate. Tali condizioni fisiopatologiche sono osservate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale, come la sclerosi multipla e il suo modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale 33-37. Qui, un passo fondamentale è la trasmigrazione delle cellule T specifiche per mielina encefalitogenici in tutto il BBB. Questo è seguito dal loro riattivazione nello spazio perivascolare e l'ingresso nel parenchima cerebrale, ove reclutano altre cellule immunitarie e mediato infiammazione e conseguente demielinizzazione 1,35,38. Tuttavia, i meccanismi molecolari dell'interazione tra tali cellule T e le cellule endoteliali, i costituenti principali della BBB, non sono ben compresi. Il nostro protocollo ha lo scopo di colmare questa lacuna e dare nuove intuizioni le conseguenze sulle cellule endoteliali (vale a dire, l'integrità barriera e permeabilità), al loro contatto diretto e complessa interazione con le cellule T attivate.
Il protocollo qui descritto fa uso di cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo primaria, coltivate come un monostrato su inserti permeabili con membrane microporose. Le cellule endoteliali sono co-coltura con cellule T CD4 +, che può essere pre-attivati sia policlonale o in maniera antigene-specifica. Co-cultura MBMECs con cellule pre-attivate, ma non naive T induce una diminuzione TEER e un aumento Ccl, che fornisce una misura quantitativa della MBMEC erettile e barriera interruzione. La tecnicanon è invasivo: utilizza built-in, invece di elettrodi bacchette, che impediscono principali disturbi del monostrato CE; esso può essere utilizzato per monitorare funzione barriera senza l'uso di marcatori cellulari. Rende misurazioni continue in modo automatico e consente una valutazione indipendente dei due parametri barriera (Teer e CCL) contemporaneamente nel corso del tempo. Il metodo è anche abbastanza sensibile per distinguere tra diversi livelli di attivazione delle cellule T e gli effetti di tali cellule T su EC.
Esso può essere utilizzato in una vasta gamma di saggi funzionali: diverse citochine e / o chemochine implicati in processi infiammatori possono essere aggiunti al co-coltura delle MBMECs e le cellule T; bloccanti anticorpi contro molecole di adesione cellulare su entrambi CE o parte delle cellule T possono essere utilizzati; e inibitori di marcatori di attivazione delle cellule T o delle loro proprietà citolitica possono essere aggiunti durante il priming di cellule T o la loro co-coltura con cellule endoteliali. Il saggio è utile anche per la trasmigrazione cellule Tsaggi, come può servire come un controllo di qualità dell'integrità monostrato MBMEC prima dell'aggiunta di cellule T. Tutto questo rende questo metodo uno strumento versatile e affidabile per studiare la BBB in vitro, con una particolare attenzione per l'effetto delle cellule T attivate sull'integrità monostrato CE. Questo è di particolare importanza per la comprensione dei meccanismi della perturbazione BBB nella patogenesi delle malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla e il suo modello animale EAE, dove, le cellule T encefalitogenici autoreattive attraversare la BBB e causano infiammazione e danno neuronale.
Diverse fasi del protocollo descritto sono essenziali per un esperimento riuscito. Durante l'isolamento MBMEC iniziale e cultura, è essenziale che il lavoro viene effettuato in condizioni sterili per quanto possibile, per evitare la contaminazione della coltura cellulare con spore fungine o batteri. Per ottenere una coltura pura di EC, si raccomanda di utilizzare un supporto contenente puromicina per i primi tre giorni, che consente la sopravvivenza di cellule endoteliali, ma non altri tipi di cellule (in particola…
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a Annika Engbers e Frank Kurth per il loro eccellente supporto tecnico e il Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) per le discussioni utili per quanto riguarda le misure teer. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 progetto A03 di HW e LK, CRC TR128, progetti A08; Z1 e B01 LK e HW, e il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (Facoltà di Medicina di Münster) codice di autorizzazione KL2 / 2015/14 a LK.
cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |