アン<em>インビトロ</em>インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

^{3 –}血液脳関門は、中枢神経系^（CNS）1から全身循環を分離します。それは、細胞の自由な移動と水溶性の分子の拡散を抑制し、病原体および潜在的に有害な物質から脳を保護する物理的障壁を提供します。そのバリア機能に加えて、BBBは、神経組織の適切な機能を確実に脳実質に酸素や栄養素の配信を可能にします。 BBBの機能特性は、高度に専門性の高い電気部品は、その主要構成要素であると、その細胞および無細胞成分によって規制されています。 BBBの電気部品は、タイトジャンクション（TJ）錯体、開窓の欠如、非常に低いピノサイトーシスの活動、および恒久的に能動輸送機構が存在することを特徴とします。 BBBの他の成分EC基底膜、内皮を埋め込む周皮細胞、アストロサイトのエンドフィート=関連するパーenchymal基底膜はまた、BBB ^2,4の開発、保守および機能に寄与^{– 6}と、一緒にニューロンおよびミクログリアで、CNS ⁷を適切に機能可能に神経血管ユニット（NVU）、形成^{– 9。}

このような神経変性、炎症や感染症などの神経疾患、種々のでは、BBBの機能が^2,5,10損なわれています。 TJ複合体および分子輸送機構の調節不全は、BBBの透過性、白血球の血管外遊出、炎症および神経損傷の増加につながります。そのような病態生理学的条件下で、BBBの特性を研究するために、様々なインビトロ BBBモデルは^9,11,12が確立されています。彼らは一緒に障壁の完全性、透過性だけでなく、輸送機構の変化に貴重な洞察を提供してきました。これらのモデルは、ヒト、マウス、ラット、ブタまたはBの内皮細胞を用いますヒツジの原点^{13から18; 25 –}初代内皮細胞または細胞株は、モノカルチャーとして、あるいは一緒に生体内 ¹⁹ でより密接にBBBを模倣するために、周皮細胞および/またはアストロサイトのいずれかで培養されます。近年では、経内皮電気抵抗（TEER）の測定は、内皮バリア特性^26,27を評価するための広く受け入れられているツールとなっています。

TEERは、細胞単層を横切るイオンフラックスに対するインピーダンスを反映し、その減少が損なわ内皮障壁の完全性、したがって透過性の増大の敏感な尺度を提供します。 ^{30 –}様々なTEER測定システムは、上皮Voltohmmeter（EVOM）、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）、リアルタイム細胞解析^15,28を含む、開発されてきました。 TEERは、隣接するECの間のイオンフラックス（傍細胞経路）に対する抵抗性を反映し、に直接比例しています関門の完全性。インピーダンス分光法^27,31においては、複素合計インピーダンス（Z）は、CCLを測定することによって、障壁の完全性についての追加情報を提供する、測定されます。 CCLは、細胞膜（経細胞経路）を介して容量性電流に関する：細胞層は、膜の両側での電荷分離、等価電気回路におけるコンデンサと同様に機能し、障壁の完全性に反比例します。透過性インサート上で成長させた場合には、ECが、付着増殖し、微多孔膜に広がります。これは、（それ自体がコンデンサのように作用する）のインサートのバックグラウンド容量性電流に抵抗し、その最低レベルに達するまでの容量の低下を招きます。これは、TJの確立隣接する電気部品との間のスペースからそのシールを複合体が続いています。これは、傍細胞経路を介してイオン流束を制限し、そしてそれがそのプラトーに達するまでTEERが増加します。炎症状態下で、しかし、endotheliアル障壁が侵害された：TJが破壊を取得複合体およびインサートの容量成分が再び上昇するとCCLが増加するにつれて、TEERは減少します。

私たちのTEERの測定は、自動化されたセル監視³²システムを使用しています。それは、インピーダンス分光法の原理に従っており、その前のアプリケーションを拡張します。ここでは、免疫細胞と脳内皮の相互作用を含むバリア性の研究を可能にインビトロ BBBモデルを記述します。特に、T細胞を活性化します。 ^{37 –}このような病態生理学的状態は、多発性硬化症およびその動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎³³のようなCNSの自己免疫疾患において観察されます。ここで、重要なステップは、BBBを横切る脳炎誘発性、ミエリン特異的T細胞の遊出があります。これは、それらが他の免疫細胞を動員し、私血管周囲空間と脳実質への参入、中にそれらの再活性化が続いていますdiate炎症およびその後の脱髄^1,35,38。しかしながら、このようなT細胞と内皮細胞との相互作用の分子機構は、BBBの主な成分は、よく理解されていません。私たちのプロトコルは、このギャップを埋め、活性化T細胞との直接接触との複雑な相互作用の際に内皮細胞（ すなわち、障壁の完全性と透過性）に影響新たな洞察を与えることを目指しています。

ここで説明するプロトコルは、微多孔膜と通気性のインサート上の単層として成長した初代マウス脳微小血管内皮細胞を利用します。内皮細胞を、ポリクローナルまたは抗原特異的な様式で予備活性化することができるCD4 ⁺ T細胞と共培養されます。予め活性化とMBMECsの共培養ではなく、ナイーブT細胞TEERの低下やMBMEC機能障害およびバリア破壊の定量的な尺度を提供するCCLの増加を誘導します。技術非侵襲的である：それは、EC単層の主要な乱れを防ぐビルトインの代わりに箸電極を、使用しています。細胞マーカーを使用することなく、バリア機能を監視するために使用することができます。これは、自動化された方法で連続測定を行うと同時に、時間をかけて2バリアパラメータ（TEERとCCL）の独立した評価を可能にします。この方法はまた、別のT細胞活性化のレベルとのECのようなT細胞の効果を区別するのに十分な感度です。

これは、機能的アッセイの広い範囲で使用することができる：炎症プロセスに関与する種々のサイトカインおよび/またはケモカインはMBMECs及びT細胞の共培養物に添加することができます。 ECまたはT細胞側のいずれかの細胞接着分子に対するブロッキング抗体を使用することができます。およびT細胞活性化マーカーの、またはそれらの細胞傷害特性の阻害剤は、T細胞プライミングまたは電気部品との共培養の間に添加することができます。アッセイはまた、T細胞の遊出するのに便利ですこれはT細胞の添加前にMBMEC単層の完全性の品質管理としての役割を果たすことができるようにアッセイ。このすべてが、この方法EC単層の完全性に活性化T細胞の効果に焦点を当てて、in vitroで BBBを研究するための汎用性と信頼性の高いツールになります。これは、自己反応、脳炎誘発性T細胞がBBBを横断し、炎症および神経損傷を引き起こすMS、その動物モデルEAEなどの自己免疫疾患の病因にBBB破壊のメカニズムを理解するために特に重要です。