Un<em> In vitro</em> Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d'impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

La barrière hémato-encéphalique sépare la circulation systémique du système nerveux central (SNC) ^{1 – 3.} Il fournit une barrière physique qui empêche la libre circulation des cellules et la diffusion des molécules solubles dans l'eau et protège le cerveau contre les agents pathogènes et des substances potentiellement nocives. En plus de sa fonction de barrière, la BHE permet l'apport d'oxygène et de nutriments pour le parenchyme du cerveau, ce qui assure le bon fonctionnement du tissu neuronal. Propriétés fonctionnelles du BBB sont très réglementés par ses composants cellulaires et acellulaires, avec CEs hautement spécialisé étant son principal élément structurel. CEs de la BHE sont caractérisés par la présence de jonctions serrées (TJ) de complexes, le manque de fenestrations, très faible activité pinocytaire, et les mécanismes de transport actives en permanence. D'autres composantes du BBB La membrane basale CE, péricytes enrobage de l'endothélium, astrocytaires pieds d'extrémité et = par associémembrane basale de enchymal contribuent également au développement, la maintenance et le fonctionnement du BBB ^{2,4 – 6} et, de concert avec les neurones et les microglies, forment l'unité neurovasculaire (NVU), qui permet le bon fonctionnement du CNS ^7-9.

Dans une variété de maladies neurologiques, telles que la neuro – dégénératives, des maladies inflammatoires ou infectieuses, la fonction de la BHE est compromise ^2,5,10. Dysrégulation de TJ complexes et les mécanismes de transport moléculaire entraîne une augmentation de la perméabilité BBB, leucocytaire extravasation, l'inflammation et des lésions neuronales. Afin d'étudier les propriétés BBB dans de telles conditions physiopathologiques, divers modèles in vitro de BBB ont été établies ^9,11,12. Ensemble, ils ont fourni des indications précieuses sur les changements de l'intégrité de la barrière, la perméabilité ainsi que des mécanismes de transport. Ces modèles utilisent des cellules endothéliales humaines, de souris, de rat, de porc ou de borigine ovine ^{13 – 18;} les cellules endothéliales primaires ou de lignées de cellules sont cultivées soit en monoculture ou conjointement avec les péricytes et / ou des astrocytes dans le but d'imiter plus étroitement la BHE in vivo ^19-25. Ces dernières années, la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER) est devenu un outil largement accepté pour évaluer les propriétés de barrière endothéliale ^26,27.

TEER reflète l'impédance au flux d'ions à travers la monocouche cellulaire et sa diminution fournit une mesure sensible de l'intégrité de la barrière endotheliale compromise et par conséquent une plus grande perméabilité. Divers systèmes de mesure de TEER ont été mis au point, y compris épithéliale Voltohmmeter (EVOM), Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS), et analyse en temps réel des cellules ^{15,28 – 30.} TEER reflète la résistance au flux d'ions entre CEs adjacentes (voie paracellulaire) et est directement proportionnelle à laintégrité de la barrière. En impédance spectroscopie ^27,31, impédance totale complexe (Z) est mesurée, qui fournit des informations supplémentaires sur l'intégrité de la barrière en mesurant Ccl. Ccl se rapporte au courant capacitif à travers la membrane cellulaire (transcellulaire passage): la couche cellulaire se comporte comme un condensateur dans le circuit électrique équivalent, la séparation des charges sur les deux côtés de la membrane et est inversement proportionnelle à l'intégrité de la barrière. Lorsqu'il est cultivé sur des inserts perméables, CEs adhèrent, prolifèrent et étalée sur la membrane microporeuse. Résiste à ce courant capacitif de fond de l'insert (qui lui-même agit comme un condensateur) et conduit à une baisse de la capacité jusqu'à ce qu'elle atteigne son niveau minimal. Elle est suivie par la mise en place de TJ complexes qui joint l'espace entre CEs adjacents. Cela restreint le flux d'ions à travers la voie paracellulaire et TEER augmente jusqu'à ce qu'il atteigne son plateau. Dans des conditions inflammatoires, cependant, le endothelial barrière est compromise: TEER diminue à mesure que les complexes TJ se perturbé et Ccl augmente à mesure que la composante capacitive de l'insert augmente à nouveau.

Notre mesure TEER utilise la surveillance automatisée des cellules ³² du système: il suit le principe de la spectroscopie d'impédance et étend ses applications précédentes. Ici, nous décrivons un modèle in vitro BBB qui permet l'étude des propriétés de barrière, y compris l'interaction de l' endothélium cérébral avec les cellules immunitaires; en particulier les lymphocytes T activés. De telles conditions physiopathologiques sont observées dans les maladies auto – immunes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et de son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto – immune ^33-37. Ici, une étape cruciale est la transmigration des cellules T spécifiques de la myéline encéphalitogéniques à travers la BHE. Ceci est suivi par leur réactivation dans l'espace périvasculaire et l'entrée dans le parenchyme du cerveau, où ils recrutent d'autres cellules immunitaires et mel' inflammation diate et démyélinisation ultérieure ^1,35,38. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales, les principaux constituants de la BHE, ne sont pas bien comprises. Notre protocole vise à combler cette lacune et donner de nouvelles perspectives sur les conséquences sur les cellules endothéliales ( par exemple, l' intégrité de la barrière et de perméabilité) lors de leur contact direct et interaction complexe avec les cellules T activées.

Le protocole décrit ici utilise des cellules du cerveau endothéliales microvasculaires de souris primaires, cultivées en monocouche sur des inserts perméables avec des membranes microporeuses. Les cellules endothéliales sont co-cultivées avec des cellules T CD4 ^+, qui peut être pré-activé soit polyclonale ou d'une manière spécifique de l' antigène. Co-culture de cellules T avec MBMECs pré-activé, mais pas naïf induit une diminution de la TEER et une augmentation de la CCl, qui fournit une mesure quantitative du dysfonctionnement et la rupture de la barrière MBMEC. La techniqueest non-invasive: il utilise intégré à la place d'électrodes de baguettes, qui empêchent perturbation majeure de la monocouche CE; il peut être utilisé pour surveiller la fonction de barrière sans l'utilisation de marqueurs cellulaires. Il effectue des mesures continues de manière automatisée et permet une évaluation indépendante des deux paramètres de barrière (TEER et Ccl) simultanément au fil du temps. Le procédé est également suffisamment sensible pour faire la distinction entre les différents niveaux d'activation des lymphocytes T et les effets de ces cellules T sur CEs.

Il peut être utilisé dans une large gamme de dosages fonctionnels: les différentes cytokines et / ou chimiokines impliquées dans les processus inflammatoires peuvent être ajoutés à la co-culture de MBMECs et les lymphocytes T; blocage des anticorps dirigés contre des molécules d'adhésion cellulaire de chaque côté de la CE, ou des cellules T peuvent être utilisées; et des inhibiteurs de marqueurs d'activation des lymphocytes T ou de leurs propriétés cytolytiques peuvent être ajoutés au cours de l'amorçage des cellules T ou de leur co-culture avec CEs. L'essai est également utile pour la transmigration des cellules Tdes essais, car il peut servir de contrôle de la qualité de l'intégrité de la monocouche MBMEC avant l'addition des cellules T. Tout cela fait de cette méthode un outil polyvalent et fiable pour étudier la BHE in vitro, avec un accent sur l'effet des lymphocytes T activés sur l' intégrité de la monocouche CE. Ceci est d'une importance particulière pour la compréhension des mécanismes de la perturbation BBB dans la pathogenèse des maladies auto-immunes, telles que MS et son modèle animal EAE, où, les cellules T encéphalitogéniques autoréactives traversent la BHE et provoquent une inflammation et des lésions neuronales.