Een<em> In Vitro</em> Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

De bloed-hersenbarrière scheidt de systemische circulatie van het centrale zenuwstelsel (CNS) ^1-3. Het voorziet in een fysieke barrière die het vrije verkeer van cellen en de verspreiding van in water oplosbare moleculen remt en beschermt de hersenen tegen pathogenen en potentieel schadelijke stoffen. Naast de barrièrefunctie de BBB maakt de overdracht van zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen parenchym waardoor de correcte werking van het neuronaal weefsel waarborgt. Functionele eigenschappen van de BBB wordt sterk gereguleerd door zijn cellulaire en acellulaire componenten, met zeer gespecialiseerde EC dat is haar belangrijkste structurele element. EC van de BBB wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van tight junction (TJ) complexen, het gebrek aan fenestrations, pinocytose extreem lage activiteit en permanent actieve transportmechanismen. Andere componenten van de BBB de EC basaal membraan, pericytes het inbedden van het endotheel, astrocytaire end voeten en = bijbehorende parenchymal basaalmembraan ook bijdragen aan de ontwikkeling, instandhouding en functie van de BBB ^{2,4 – 6} en samen met neuronen en microglia, vormen de neurovasculaire eenheid (NVU) waardoor de correcte werking van het CZS ⁷ maakt ^{– 9.}

In verschillende neurologische ziekten zoals neurodegeneratieve, ontstekings- of infectieziekten, is de functie van de BBB gecompromitteerde ^2,5,10. Ontregeling van TJ complexen en moleculaire transportmechanismen leidt tot BBB permeabiliteit extravasatie van leukocyten, ontsteking en neuronale schade toe. Om BBB eigenschappen studeren onder dergelijke pathofysiologische omstandigheden, hebben verschillende in vitro BBB modellen vastgesteld ^9,11,12. Samen hebben ze waardevolle inzichten in de veranderingen van de barrière integriteit, doorlaatbaarheid evenals transport mechanismen. Deze modellen maken gebruik endotheliale cellen van mens, muis, rat, varken of bschapen afkomst ^13-18; primaire endotheliale cellen of cellijnen worden gekweekt hetzij als monocultuur of samen met pericyten en / of astrocyten om nauwer bootsen de BBB in vivo ^19-25. De laatste jaren is het meten van transendotheliale elektrische weerstand (TEER) wordt een algemeen aanvaarde instrument om endotheliale barrière-eigenschappen ^26,27 beoordelen.

TEER weerspiegelt de impedantie op de ionenflux over de cel monolaag en de afname verschaft een gevoelige maatstaf van gecompromitteerde endotheliale barrière integriteit en derhalve verhoogde permeabiliteit. Diverse TEER meetsystemen zijn ontwikkeld, waaronder epitheliale Voltohmmeter (EVOM), elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS), en real-time cell analyse ^{15,28 – 30.} TEER weerspiegelt de weerstand tegen ion flux tussen aangrenzende EC (paracellulaire route) en is recht evenredig met debarrière integriteit. In impedantie spectroscopie ^27,31, is complex totale impedantie (Z) gemeten, die meer informatie over de barrière integriteit door het meten van Ccl biedt. Ccl betreft de capacitieve stroom door het celmembraan (transcellulaire route): de cellaag fungeert als een condensator in het equivalente elektrische circuit, het scheiden van de lasten aan beide zijden van het membraan en is omgekeerd evenredig met de barrière integriteit. Wanneer geteeld op doorlatende inserts, EC hechten, vermenigvuldigen en verspreid over het microporeuze membraan. Dit weerstaat de achtergrond capacitieve stroom van het inzetstuk (die zelf werkt als een condensator) en leidt tot een afname van de capaciteit tot aan de minimale niveau bereikt. Dit wordt gevolgd door de instelling van TJ complexen die afdichting van de ruimte tussen aangrenzende EC. Dit beperkt de ion flux door de paracellulaire route en TEER verhoogt tot het zijn plateau bereikt. Onder ontstekingstoestanden, maar de endothelial barrière in het gedrang komt: TEER afneemt als TJ complexen krijgen verstoord en Ccl toeneemt naarmate de capacitieve component van het inzetstuk weer stijgt.

Onze TEER meting maakt gebruik van de geautomatiseerde celbewaking ³² systeem: het volgt het principe van impedantie spectroscopie en breidt haar eerdere aanvragen. Hier beschrijven we een in vitro model BBB dat de studie van de barrière-eigenschappen, zoals de interactie van hersenen endotheel met immuuncellen mogelijk maakt; met name geactiveerde T-cellen. Zulke pathofysiologische aandoeningen zijn waargenomen bij auto-immuunziekten van het CZS, zoals multiple sclerose en diermodel experimentele autoimmune encefalomyelitis ^33-37. Hier, een cruciale stap is de transmigratie van encefalitogene, myeline-specifieke T-cellen over de BBB. Dit wordt gevolgd door reactivering in de perivasculaire ruimte en het in het hersenparenchym, waar ze rekruteren andere immuuncellen en melijke ontsteking en daaropvolgende demyelinatie ^1,35,38. Echter, de moleculaire mechanismen van de interactie tussen deze T-cellen en endotheelcellen, de hoofdbestanddelen van de BBB, zijn niet goed begrepen. Ons protocol is bedoeld om deze leemte op te vullen en geeft nieuwe inzichten in de gevolgen op endotheelcellen (dat wil zeggen, barrière integriteit en permeabiliteit) op hun directe contact en de complexe interactie met geactiveerde T-cellen.

De hier beschreven protocol maakt gebruik van primaire muizenhersenen microvasculaire endotheliale cellen, gekweekt als een monolaag op permeabele inserts met microporeuze membranen. Endotheelcellen samen gekweekt met CD4 ⁺ T-cellen, die vooraf worden geactiveerd hetzij polyklonaal of een antigeen-specifieke wijze. Co-cultuur van MBMECs met pre-geactiveerde, maar niet naïeve T-cellen induceert een daling van TEER en een toename van Ccl die een kwantitatieve meting van de MBMEC dysfunctie en barrièrebeschadiging verschaft. de techniekis non-invasief: het gebruikt ingebouwde plaats van eetstokje elektroden, die belangrijke verstoring van de EC monolaag te voorkomen; het kan worden gebruikt om de barrièrefunctie te controleren zonder het gebruik van celmarkers. Het maakt continue metingen op een geautomatiseerde manier en maakt een onafhankelijke beoordeling van de twee barrière parameters (TEER en Ccl) tegelijkertijd in de tijd. De werkwijze is gevoelig genoeg om onderscheid te maken tussen verschillende T cel activering en werking van dergelijke T-cellen op EC.

Het kan worden gebruikt in een breed scala aan functionele testen: verschillende cytokinen en / of chemokinen betrokken bij ontstekingsprocessen kunnen de co-cultuur van MBMECs en T-cellen worden toegevoegd; blokkerende antilichamen tegen celadhesie moleculen aan beide EG of T-cel zijde kan worden gebruikt; en inhibitoren van T-cel activatie merkers of hun cytolytische eigenschappen kunnen tijdens de T-cel priming of de co-kweek met EC's worden toegevoegd. De test is ook bruikbaar voor T-cel transmigratieassays, omdat het als een kwaliteitscontrole van de integriteit MBMEC monolaag voorafgaande aan de toevoeging van T-cellen kunnen dienen. Dit alles maakt deze methode een veelzijdig en betrouwbaar instrument om de BBB in vitro onderzoek, met een focus op het effect van geactiveerde T-cellen op monolaag integriteit EC. Dit is van bijzonder belang voor het begrijpen van de mechanismen van de BBB verstoring in de pathogenese van auto-immuunziekten, zoals MS en EAE diermodel, waarbij autoreactieve, encefalitogene T-cellen steek de BBB en ontsteking en neuronale schade.