ل<em> في المختبر</em> نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية
Summary
Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Abstract
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
Introduction
حاجز الدم في الدماغ يفصل جهاز الدورة الدموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1-3. وهو يوفر حاجز مادي أن يمنع حرية حركة الخلايا وانتشار الجزيئات القابلة للذوبان في الماء ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض والمواد الضارة المحتملة. بالإضافة إلى وظيفة الجدار العازل، وBBB تمكن من إيصال الأوكسجين والمواد المغذية لحمة الدماغ، والتي تضمن حسن سير العمل في الأنسجة العصبية. الخصائص الفنية للBBB درجة عالية من التنظيم من قبل المكونات الخلوية وديكي لها، مع درجة عالية من التخصص ECS كونها العنصر الهيكلي الرئيسي. تتميز ECS من BBB من وجود تقاطع ضيق (TJ) المجمعات، وعدم وجود fenestrations، النشاط pinocytic منخفضة للغاية، وآليات النقل نشطة بشكل دائم. مكونات أخرى من BBB الغشاء القاعدي EC، pericytes تضمين البطانة، قدم نهاية نجمي و= المرتبطة قدم المساواةenchymal الغشاء القاعدي أيضا أن تسهم في تطوير وصيانة وظيفة من BBB 2،4 – 6 و، جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة، تشكل وحدة وعائية عصبية (NVU)، والتي تمكن حسن سير العمل في الجهاز العصبي المركزي 7-9.
في مجموعة متنوعة من الأمراض العصبية، مثل الاعصاب، والأمراض الالتهابية أو المعدية، وظيفة BBB للخطر 2،5،10. ديسريغولاتيون من TJ المجمعات وآليات النقل الجزيئية يؤدي إلى زيادة نفاذية BBB، تسرب الكريات البيض، والتهاب وتلف الخلايا العصبية. من أجل دراسة خصائص BBB في ظل هذه الظروف المرضية، وقد وضعت مختلف في المختبر نماذج BBB 9،11،12. معا كانوا قد قدموا معلومات قيمة حول التغييرات النزاهة الحاجز، نفاذية وكذلك آليات النقل. هذه النماذج تستخدم الخلايا البطانية من البشر، الجرذان والفئران، الخنزير أو بالأغنام أصل 13-18. الخلايا البطانية الأولية أو خطوط الخلايا يتم استزراع إما الأحادية أو جنبا إلى جنب مع pericytes و / أو الخلايا النجمية لتحاكي بشكل وثيق BBB في الجسم الحي 19-25. في السنوات الأخيرة، أصبح قياس المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) أداة مقبولة على نطاق واسع لتقييم خصائص حاجز غشائي 26،27.
يعكس طير مقاومة لتدفق الأيونات عبر أحادي الطبقة الخلية ويوفر انخفاضه مقياس حساسية للخطر سلامة حاجز غشائي، وبالتالي زيادة نفاذية. وقد وضعت العديد من أنظمة قياس طير، بما في ذلك طلائي Voltohmmeter (EVOM)، الكهربائية الخلوي الركيزة الممانعة الاستشعار (ECIS)، وتحليل الخلايا في الوقت الحقيقي 15،28 – 30. يعكس طير المقاومة لتدفق الأيونات بين ECS المجاورة (paracellular الطريق) وهو يتناسب طرديا معسلامة الحاجز. في مقاومة الطيفي 27،31، يتم قياس مقاومة الإجمالية المعقدة (Z)، الذي يوفر معلومات إضافية حول سلامة الحاجز عن طريق قياس جنة علم المناخ. لجنة علم المناخ يتعلق بالسعة الحالية من خلال غشاء الخلية (الطريق العابر لل): طبقة الخلايا تتصرف مثل مكثف في الدائرة الكهربائية ما يعادلها، فصل رسوم على جانبي الغشاء وهي عكسيا يتناسب مع سلامة الحاجز. عندما نمت على إدراج قابلة للاختراق، ECS الالتزام بها وتتكاثر وتنتشر على غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. هذا يقاوم الخلفية بالسعة الحالية للإدراج (الذي في حد ذاته يتصرف مثل مكثف) ويؤدي إلى انخفاض في السعة حتى يصل إلى مستوى الحد الأدنى. ويعقب ذلك من خلال إنشاء مجمعات TJ أن ختم قبالة الفضاء بين ECS المجاورة. وهذا يحد من تدفق الأيونات عبر الطريق paracellular، وطير يزيد حتى يصل إلى هضبة لها. في ظل ظروف التهابات، ومع ذلك، فإن endotheliتم المساس آل الحاجز: طير يتناقص مجمعات TJ الحصول على تعطلت ولجنة علم المناخ يزيد باعتبارها العنصر بالسعة من إدراج يرتفع مرة أخرى.
يستخدم قياس طير لدينا نظام آلي مراقبة الخلية 32: يترتب على مبدأ التحليل الطيفي مقاومة وتمتد تطبيقاته السابقة. هنا، نحن تصف في المختبر نموذج BBB التي تمكن من دراسة خصائص الحاجز، بما فيها تفاعل بطانة الدماغ مع الخلايا المناعية. ولا سيما تنشيط خلايا تي. ولوحظت هذه الظروف المرضية في أمراض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي، مثل التصلب المتعدد ونموذج حيواني التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي في 33-37. هنا، خطوة حاسمة هي التهجير من دماغي المنشأ، وخلايا T-المايلين محددة عبر BBB. ويتبع ذلك تنشيط في الحيز المحيط بالأوعية ودخول حمة الدماغ، حيث تجنيد الخلايا المناعية الأخرى، وليالتهاب diate ولاحق إزالة الميالين 1،35،38. ومع ذلك، الآليات الجزيئية للتفاعل بين هذه الخلايا التائية والخلايا البطانية، والمكونات الرئيسية من بي بي بي، ليست مفهومة جيدا. ويهدف بروتوكول لدينا لملء هذه الفجوة وإعطاء رؤى جديدة في العواقب على الخلايا البطانية (أي سلامة الحاجز والنفاذية) عند الاتصال بهم مباشرة وتفاعل معقد مع تنشيط خلايا تي.
بروتوكول الموصوفة هنا يجعل من استخدام الماوس الأساسي خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية، كما نمت أحادي الطبقة على إدراج نفاذية الأغشية مع الصغيرة التي يسهل اختراقها. وشارك في تربيتها الخلايا البطانية مع خلايا CD4 + T، التي يمكن أن تكون مرحلة ما قبل تفعيلها إما polyclonally أو بطريقة مستضد معين. شارك في ثقافة MBMECs مع خلايا T قبل تفعيلها، ولكن ليس ساذجا يؤدي الى انخفاض في طير وزيادة في لجنة علم المناخ، والذي يقدم مقياسا كميا لMBMEC الخلل وحاجز انقطاع. التقنيةهو غير الغازية: ويستخدم في البناء بدلا من الأقطاب الكهربائية عود، التي تحول دون اضطراب كبير من أحادي الطبقة EC. أنها يمكن أن تستخدم لمراقبة وظيفة الحاجز من دون استخدام علامات الخلية. يجعل القياسات المستمرة بطريقة آلية وتمكن تقييم مستقل من المعلمات حاجز اثنين (طير ولجنة علم المناخ) في وقت واحد مع مرور الوقت. هذه الطريقة أيضا حساسة بما يكفي للتمييز بين مستويات مختلفة من تنشيط الخلايا T وآثار هذه الخلايا التائية على ECS.
ويمكن استخدامه في مجموعة واسعة من المقايسات الفنية: السيتوكينات مختلفة و / أو كيموكينات المتورطين في عمليات التهابات يمكن أن تضاف إلى ثقافة مشتركة من MBMECs وخلايا تي. منع الأجسام المضادة ضد جزيئات التصاق الخلية على أي من المفوضية الأوروبية أو الجانب تي خلية يمكن استخدامها. ومثبطات تي علامات تنشيط الخلايا أو ممتلكاتهم لحل الخلايا يمكن أن تضاف خلال فتيلة تي خلية أو زملائهم في الثقافة مع ECS. الفحص مفيد أيضا للهجرة خلايا Tالمقايسات، لأنها يمكن أن تكون بمثابة مراقبة جودة MBMEC سلامة أحادي الطبقة السابقة لإضافة خلايا تي. كل هذا يجعل هذه الطريقة أداة مرنة وموثوق بها لدراسة BBB في المختبر، مع التركيز على تأثير تنشيط خلايا تي في المفوضية الأوروبية سلامة أحادي الطبقة. هذا الأمر أهمية خاصة لفهم آليات تعطل BBB في التسبب في أمراض المناعة الذاتية، مثل مرض التصلب العصبي المتعدد ونموذج حيواني لEAE، حيث تعبر، وخلايا T دماغي المنشأ ذاتية التفاعل بي بي بي وتسبب التهاب وتلف الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عدة خطوات من بروتوكول صفها ضرورية لإجراء تجربة ناجحة. خلال العزلة MBMEC الأولية والثقافة، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ العمل تحت ظروف معقمة قدر الإمكان، لمنع التلوث من ثقافة الخلية مع الجراثيم الفطرية أو البكتيريا. من أجل الحصول على ثقافة نقية من ECS، فمن المستحسن است?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لأنيكا Engbers وفرانك كورث حصول على الدعم الفني الممتاز والدكتور ماركوس شافر (nanoAnalytics GmbH ل) لإجراء مناقشات مفيدة بشأن القياسات طير. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، SFB1009 مشروع A03 إلى الأب وLK، CRC TR128، مشاريع A08. Z1 وB01 لوقا والأب، ومركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (كلية الطب في مونستر) عدد المنح Kl2 / 2015/14 لوقا.
Materials
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
| Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
| flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
| FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
| Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
| Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
| Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
| 24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
| 96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
| Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
| MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
| Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
| Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
| Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
| Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
| Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
| DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
| Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
| Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
| Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
| Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
| IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
| L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
| mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
| purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
| purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
| Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
| Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
| NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
| Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
| PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |
References
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Luissint, A. -. C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -. O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23 (2012).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
- Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence?. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
- Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204 (2014).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
- Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022 (2012).
- Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5 (2013).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
- Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766 (2014).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , (2011).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
- Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide – How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
- Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
- von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -. J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
- Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
- Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
- Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889 (2015).
- Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
- Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -. J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
- Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
- Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
- Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784 (2012).
- Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
