bir<em> İn Vitro</em> Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

^{3 -,} kan-beyin bariyeri, merkezi sinir sistemi (MSS) ¹ sistemik dolaşıma ayırır. Bu hücrelerin serbest dolaşımını ve suda çözünen moleküllerin difüzyon engeller ve patojenler ve potansiyel olarak zararlı maddelerden koruyan beyin fiziksel bir engel oluşturur. bariyer fonksiyonuna ek olarak, BBB nöronal doku düzgün işleyişini sağlayan beyin parankimi, oksijen ve besin iletimini sağlar. BBB fonksiyonel özellikleri son derece son derece uzmanlaşmış EC ana yapı elemanı olmak üzere, hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından düzenlenir. BBB EC sıkı birleşme (TJ) kompleksleri, fenestrasyonlar eksikliği, aşırı düşük pinocytic aktivitesi ve kalıcı olarak aktif taşıma mekanizmaları varlığı ile karakterize edilir. endotel, astrositik uç ayak ve = ilişkili par katıştırma Diğer BBB bileşenleri AK bazal membran, perisitlerenchymal bazal membran da bbb ^2,4 geliştirilmesi, bakım ve işlevine katkıda ^{– 6} ve birlikte nöronlar ve mikroglia ile merkezi sinir sistemi ⁷ doğru çalışmasını sağlayan nörovasküler birimi (NVU) meydana ^{– 9.}

Bu gibi nörodejeneratif, enflamatuar veya bulaşıcı hastalıklar gibi nörolojik hastalıklar, çeşitli, BBB fonksiyonu ^2,5,10 ele almaktadır. TJ kompleksleri ve moleküler taşıma mekanizmaları düzensizliği BBB geçirgenliği, lökosit ekstravazasyonu, enflamasyon ve nöronal hasarı sebep olur. Böyle patofizyolojik koşullarda BBB özelliklerini incelemek amacıyla, çeşitli in vitro BBB modelleri ^9,11,12 kurulmuştur. Birlikte bariyer bütünlüğünün, geçirgenlik yanı sıra taşıma mekanizmaları değişiklikleri değerli bilgiler sağlamıştır. Bu modeller, insan, fare, sıçan, domuz veya b endotel hücrelerini kullanırKoyun kökenli ^{13-18; 25 –} primer endotel hücreleri ya da hücre hatları, in vivo ¹⁹ daha yakından BBB taklit etmek için perisitler ve / veya astrositler ile tekli kültür olarak ya da birlikte kültürlenir. Son yıllarda, endotel elektrik direnci (TEER) ölçümü endotel bariyer özelliklerinin ^26,27 değerlendirmek için yaygın olarak kabul gören bir araç haline gelmiştir.

TEER hücre tek tabaka boyunca iyon akı empedansı yansıtan ve onun azalma tehlikeye endotel bariyer bütünlüğünün ve dolayısıyla artan geçirgenliği hassas bir ölçümünü sağlar. ^{30 –} Çeşitli TEER ölçüm sistemleri Epitelyal Voltohmmeter (EVOM), elektrik Hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) ve gerçek zamanlı hücre analizi ^15,28 dahil olmak üzere geliştirilmiştir. TEER bitişik EC arasındaki iyon akımının (paraselüler yol) direnç gösterir ve doğru orantılıdırbariyer bütünlüğü. Empedans spektroskopisi ^27,31 yılında, karmaşık toplam empedansı (Z) CCL ölçerek bariyer bütünlüğünün hakkında ek bilgi sağlar, hangi ölçülür. CCL hücre zarı (transsellüler yol) üzerinden kapasitif akımı ile de ilgilidir: hücre katmanı zarın her iki tarafında ücretleri ayırma eşdeğer elektrik devresinde bir kapasitör gibi davranır ve ters bariyer fonksiyonunun orantılıdır. geçirgen ekler üzerinde yetiştirilen zaman, EC, uygun çoğalırlar ve mikro gözenekli membran yayıldı. Bu (kendisi bir kondansatör gibi davranır) ve minimal seviyeye ulaşana kadar kapasitans bir azalmaya yol açar ucun arka kapasitif akımını direnç gösterir. Bu TJ kurulması takip eder komşu EC arasındaki boşluk kapalı olduğu mühür kompleksleri. Bu parasellüler yoldan iyon akı kısıtlar ve onun plato ulaşana kadar TEER arttırır. inflamatuar koşullar altında, ancak, endothelial bariyer tehlikeye: TJ bozulur olsun kompleksleri ve ekin kapasitif bileşeni tekrar yükseldiğinde Ccl arttıkça TEER azalır.

Bizim TEER ölçümü otomatik hücre izleme ³² sistemi kullanır: Bu empedans spektroskopisi prensibini takip eder ve önceki uygulamalarını uzanır. Burada, bağışıklık hücreleri ile beyin endotel etkileşimi de dahil olmak üzere bariyer özellikleri çalışma, sağlayan in vitro BBB modeli tarif; özellikle aktive edilmiş T hücreleri. ^{37 –} Bu patofizyolojik koşullar, çoklu skleroz ve hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit ³³ olarak merkezi sinir sisteminin bağışıklık hastalıklarının gözlenmektedir. Burada, çok önemli bir adımdır BBB boyunca ensefalitojenik, miyelin özgü T hücrelerinin göçü olup. Bu beyin parankimi içine perivasküler alanda ve giriş onların reaktivasyonuna tarafından takip edilir, diğer bağışıklık hücrelerini işe ve bana neredeACİL enflamasyon ve daha sonra demiyelinasyon ^1,35,38. Bununla birlikte, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimin moleküler mekanizması, BBB temel bileşenler, iyi anlaşılmamıştır. Bizim protokol bu boşluğu doldurmak ve aktive T hücreleri ile bunların doğrudan temas ve karmaşık etkileşimi üzerine endotel hücreleri (yani, bariyer bütünlüğü ve geçirgenlik) üzerinde sonuçları yeni bir bakış açısı kazandırmayı amaçlamaktadır.

Burada açıklanan protokol mikro-gözenekli membran ile geçirgen eklerde üzerinde tek-katman olarak yetiştirilen primer fare beyni mikrovasküler endotel hücreleri, kullanır. Endotel hücreleri, ortak-kültürlenir poliklonal veya antijen spesifik şekilde ya da ön-aktive ^edilebilir, CD4 ⁺ T hücreleri ile. Ön-aktifleştirilmiş, ancak saf T hücreleri ile MBMECs Co-kültür TEER bir azalmaya ve MBMEC fonksiyon bozukluğu ve engelleyici bir bozulma nicel ölçümünü sağlar CCl bir artışa da neden olur. tekniknon-invaziv: built-in yerine AT tek tabaka büyük olumsuz yönde etkilenmemesi çubuk elektrotlar, kullanır; hücre belirteçleri kullanılmadan bariyer fonksiyonunu izlemek için de kullanılabilir. Bu otomatik bir şekilde sürekli ölçümler yapar ve aynı anda zamanla iki bariyer parametreleri (TEER ve Ccl) bağımsız bir değerlendirmesini sağlar. Yöntem ayrıca, farklı T hücresi aktivasyonunun seviyeleri ve EC ile T hücrelerinin etkilerini ayırt kadar hassastır.

Bu fonksiyonel analizlerin geniş bir kullanılabilir: inflamatuar süreçlere de karışırlar farklı sitokinler ve / veya kemokin MBMECs ve T hücrelerinin ko-kültür ilave edilebilir; EC ya da T-hücresi, her iki yanında, hücre yapışma moleküllerinin karşı bloke edici antikorlar kullanılabilir; ve T hücre aktivasyon işaretleme maddelerinin veya sitolitik özellikleri inhibitörleri, T-hücresi priming veya EC ile ko-kültür sırasında ilave edilebilir. Tahlil, aynı zamanda, T-hücresi göçü için kullanışlıdırdeneyler, bu T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, MBMEC tek tabaka bütünlüğünün bir kalite kontrol olarak hizmet edebilmektedir. Bütün bu yöntemini AK tek tabaka bütünlüğünü aktive T hücrelerinin etkisi odaklanarak, in vitro BBB incelemek için çok yönlü ve güvenilir bir araçtır. Bu, kendi kendine reaktif ensefalitojenik T hücreleri BBB çapraz ve enflamasyon ve nöronal zarara neden MS ve hayvan modeli EAE gibi oto-bağışıklık hastalıklarının patojenezinde BBB bozulma mekanizmalarının anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır.