Ein<em> In Vitro</em> Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Die Blut-Hirn – Schranke trennt den systemischen Kreislauf aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) ^{von 1 bis 3.} Es stellt eine physikalische Barriere, die die freie Bewegung von Zellen und die Diffusion von wasserlöslichen Molekülen und schützt das Gehirn vor Krankheitserregern und potenziell schädlichen Substanzen hemmt. Zusätzlich zu seiner Barrierefunktion ermöglicht die BBB die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen an das Hirnparenchym, das einwandfreie Funktionieren des neuronalen Gewebes gewährleistet. Funktionelle Eigenschaften der BHS durch ihre zellulären und azellulären Komponenten stark reguliert, mit hochspezialisierten ECs sein Hauptstrukturelement zu sein. ECs der BBB sind durch die Anwesenheit von tight junction (TJ) -Komplexe, der Mangel an fenestrations, extrem niedrige pinocytic Aktivität und permanent aktive Transportmechanismen aus. Andere Komponenten des BBB die EG Basalmembran, pericytes Einbetten des Endothels, astrozytären Ende Füße und = zugehöriges parenchymal Basalmembran tragen auch zur Entwicklung, Wartung und Funktion der BHS ^{2,4 – 6} und zusammen mit Neuronen und Mikroglia, bilden die neurovaskuläre Einheit (NVU), das reibungslose Funktionieren des ZNS ⁷ ermöglicht ^{– 9.}

In einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, wie von neurodegenerativen, entzündlichen oder Infektionskrankheiten wird die Funktion der BBB ^2,5,10 kompromittiert. Dysregulation von TJ Komplexe und molekulare Transportmechanismen führt BHS-Permeabilität, Leukozytenextravasation, Entzündungen und neuronaler Schädigung erhöht. Um BBB Eigenschaften unter solchen pathophysiologischen Bedingungen, verschiedene in vitro BBB Modelle wurden ^9,11,12 etabliert haben zu studieren. Gemeinsam haben sie wertvolle Einblicke in die Veränderungen der Integrität der Barriere, Permeabilität sowie Transportmechanismen zur Verfügung gestellt. Diese Modelle beschäftigen Endothelzellen von Mensch, Maus, Ratte, Schwein oder bSchafen Ursprung ^13-18; primären endothelialen Zellen oder Zelllinien kultiviert werden entweder als Monokultur oder zusammen mit Perizyten und / oder Astrozyten , um genauer die BBB in vivo ¹⁹ nachzuahmen ^{– 25.} In den letzten Jahren Messung der transendothelialen elektrische Widerstand (TEER) hat Eigenschaften ^26,27 ein weithin akzeptiertes Werkzeug zur Beurteilung Endothelbarriere werden.

TEER reflektiert die Impedanz für den Ionenfluss durch die Zellmonoschicht und die Abnahme ein empfindliches Maß für kompromittiert endothelialen Integrität der Barriere und damit eine erhöhte Durchlässigkeit. Verschiedene TEER Messsysteme wurden entwickelt, darunter Epithelial Cell (Evom), E – Zell-Substrat – Impedanz – Mess (ECIS) und Echtzeit – Zellanalyse ^{15,28 – 30.} TEER reflektiert den Widerstand gegenüber der Ionenfluss zwischen benachbarten ECs (parazellulärer Weg) und ist direkt proportional zu derBarriere Integrität. In der Impedanzspektroskopie ^27,31, komplexe Gesamtimpedanz (Z) gemessen wird , die durch die Messung Ccl zusätzliche Informationen über die Integrität der Barriere zur Verfügung stellt. CCL bezieht sich durch die Zellmembran (transzelluläre Route) mit dem kapazitiven Strom: die Zellschicht wirkt wie ein Kondensator in der elektrischen Ersatzschaltung, die Ladungen auf beiden Seiten der Membran trennt und ist umgekehrt proportional zu der Barrierenintegrität. Wenn auf durchlässigen Einsätzen gewachsen, haften ECs, vermehren und die mikroporöse Membran verteilt. Dies widersteht dem Hintergrund kapazitive Strom des Einsatzes (das sich wie ein Kondensator wirkt), und führt zu einer Abnahme in der Kapazität, bis er seinen minimalen Pegel erreicht. Dies wird durch die Errichtung von TJ gefolgt Komplexe, die Dichtung aus dem Raum zwischen benachbarten ECs. Dies beschränkt den Ionenfluss durch den parazellulären Weg und TEER erhöht, bis es seine Plateau erreicht. Unter entzündlichen Bedingungen wird jedoch die endothelial Barriere beeinträchtigt: TEER abnimmt, wenn TJ erhalten gestört Komplexen und Ccl zunimmt, wenn die kapazitive Komponente des Einsatzes wieder ansteigt.

Unsere TEER Messung nutzt die automatisierte Zellenüberwachung ³² System: Es folgt dem Prinzip der Impedanzspektroskopie und erweitert seine bisherigen Anwendungen. Hier beschreiben wir ein in vitro BBB Modell, das die Untersuchung der Barriereeigenschaften ermöglicht, einschließlich der Interaktion von Hirn Endothel mit Immunzellen; insbesondere aktivierte T-Zellen. ^{37 –} solche pathophysiologischen Bedingungen sind bei Autoimmunerkrankungen des ZNS, wie Multiple Sklerose und seine Tiermodell experimenteller Autoimmun – Enzephalomyelitis ³³ beobachtet. Hierbei ist ein entscheidender Schritt ist die Transmigration von enzephalitogenen, Myelin-spezifischen T-Zellen über die BBB. Dies wird durch die Reaktivierung im perivaskulären Raum und den Eintritt in das Hirnparenchym gefolgt, wo sie rekrutieren andere Immunzellen und mirschen Entzündung und anschließender Demyelinisierung ^1,35,38. Jedoch molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen diesen T-Zellen und Endothelzellen, die wichtigsten Bestandteile der BBB, sind nicht gut verstanden. Unser Protokoll zielt darauf ab , diese Lücke zu füllen und neue Erkenntnisse über die Auswirkungen auf die Endothelzellen (dh Barriere Integrität und Permeabilität) auf ihren direkten Kontakt und komplexe Zusammenspiel mit aktivierten T – Zellen geben.

Das hier beschriebene Protokoll nutzt primäre Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen, als eine Monoschicht auf durchlässigen Einsätzen mit mikroporösen Membranen gewachsen. Endotheliale Zellen co-kultiviert mit CD4 ⁺ T – Zellen, die voraktiviert entweder polyklonal oder in einer Antigen-spezifischen Art und Weise werden kann. Co-Kultur von MBMECs mit voraktivierten, aber nicht naiver T-Zellen induziert eine Abnahme der TEER und eine Zunahme in CCl, die ein quantitatives Maß für die Störung MBMEC Dysfunktion und Barriere bereitstellt. Die Technikist nicht-invasiv: es statt chopstick Elektroden Einbau-Anwendungen, die große Störung der EC-Monoschicht zu verhindern; es kann Barrierefunktion zu überwachen, ohne die Verwendung von Zellmarker verwendet werden. Es macht kontinuierliche Messungen in einer automatisierten Weise und ermöglicht eine unabhängige Beurteilung der beiden Sperrparameter (TEER und CCL) gleichzeitig über die Zeit. Das Verfahren ist auch empfindlich genug, um zwischen verschiedenen Ebenen der T-Zellaktivierung und Wirkungen solcher T-Zellen auf ECs zu unterscheiden.

Es kann in einem weiten Bereich von funktionellen Assays verwendet werden: verschiedene Cytokine und / oder bei entzündlichen Prozessen beteiligt Chemokine können zur Kokultur von MBMECs und T-Zellen hinzugefügt werden; Antikörper gegen Zelladhäsionsmoleküle entweder auf der EC oder T-Zellenseite Blockierung kann verwendet werden; und Inhibitoren der T-Zellaktivierungsmarker oder ihrer zytolytischen Eigenschaften können während der T-Zell-Priming oder deren Co-Kultur mit ECs hinzugefügt werden. Der Test ist auch nützlich für die T-Zell-TransmigrationsAssays, da es als Qualitätskontrolle der MBMEC einschichtigen Integrität vor der Zugabe von T-Zellen dienen kann. All dies macht diese Methode ein vielseitiges und zuverlässiges Werkzeug , um die BBB in vitro zu studieren, mit einem Fokus auf die Wirkung von aktivierten T – Zellen , die auf EC einschichtigen Integrität. Dies ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der BBB Störung in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise MS und ihre EAE-Tiermodell, wo selbstreaktive, enzephalitogenen T-Zellen, die BBB durchqueren und Entzündungen und neuronalen Schäden führen.