Здесь мы описываем протоколы для срыва клетки млекопитающих твердотельного размола при криогенной температуре, производят клеточный экстракт из полученного порошка клеток, и изолируют белковые комплексы, представляющие интерес с помощью аффинной захвата на антителах в сочетании микронного масштаба парамагнитных бусинок.
Affinity захват является эффективным методом выделения эндогенных белковых комплексов для дальнейшего изучения. При использовании в сочетании с антителом, этот метод также часто называют иммунопреципитации. Сродство захвата могут быть применены в стендовом масштабе и в контексте, с высокой пропускной способностью. В сочетании с белком масс-спектрометрии, сродства захвата оказалась рабочая лошадка анализа интерактомные. Хотя есть потенциально много способов, чтобы выполнить многочисленные этапы, следующие протоколы реализации наших благоволят методов. Две особенности являются отличительными: использование cryomilled порошка клеток для получения клеточных экстрактов, а также антитело в сочетании парамагнитными гранулами в качестве аффинной среды. Во многих случаях мы получили превосходные результаты с результатами, полученными при использовании обычных методов захвата сродства. Cryomilling позволяет избежать многочисленных проблем, связанных с другими формами клеточного обрыва. Это обеспечивает эффективное разрушение материала, избегая при этом denatвопросы, связанные с гурирование нагрева или вспенивания. Он сохраняет нативного белка концентрации вплоть до точки экстракции, смягчающие макромолекулярную диссоциации. Это уменьшает время, экстрагированные белки проводят в растворе, ограничивая пагубное ферментативной активностью, и это может привести к снижению неспецифической адсорбции белков с помощью аффинной среды. Микронных магнитного сродства СМИ стали все более распространенным явлением в течение последних нескольких лет, все чаще заменяют традиционную agarose- и сефароза-СМИ. Основные преимущества магнитных носителей включают в себя, как правило, более низкую неспецифической адсорбции белка; предельный размер исключения, потому что белок, связывающий комплекс не происходит на поверхности шарика, а не в порах; и легкость манипулирования и обработки с помощью магнитов.
Типичное применение представленных процедур является стабилизация и получить высокий выход и чистоту эндогенных белковых комплексов , представляющих интерес для межатомного характеристик 1. Понятно , что динамические сети обоих стабильно и скоротечно , ассоциированных макромолекулярных комплексов, в основном состоящие из белков, оркестровать клеточные процессы 2,3. Хотя существует множество экспериментальных подходов для выявления белок-белковых взаимодействий, сродства захвата является одним из наиболее широко используемых методов выделения и рассекает физиологических белковых комплексов 4-6. Кроме того, этот метод имеет преимущество с получением макромолекулярных комплексов как физических лиц, а не только в качестве точек данных в считывани; Предпочтительно, чтобы полученные таким образом комплексы могут быть использованы в множество дополнительных вниз по течению биохимических, ферментативных и структурных анализов 7-9. Представленные протоколы были разработаны в ответ на необходимость карте PROTEIсетей взаимодействия н-белка и характеризуют высокомолекулярные комплексы в их роли в качестве эффекторных молекул клеточной биологии. Они подробно описаны в отношении их применения в клетках млекопитающих, выращенных в культуре ткани, но в равной степени применимы к широкому диапазону биологических образцов заданных соответствующей системой конкретных настроек.
История сродства захвата уходит корнями в начале двадцатого века с первыми экспериментами иммуноаффинной хроматографии – напоминающие то, что обычно называют в настоящее время, как иммунопреципитации (IP) – появление в литературе в начале 1950-х годов. Mainstream использование техники дальнейшее развитие через этого столетия к настоящему 10-13. Различные клетки и молекулярно – биологические исследования использовали механическое разрушение клеток путем измельчения при криогенных температурах , по крайней мере за последние сорок лет 14-19; и молекулярно-разделений, использующие (супер) парамагнитные шарики имеют клювОме все более распространенным в течение последних двух десятилетий 20. Сочетание этих различных технологий служит для синергического улучшить результаты , которые могут быть получены в экспериментах белкового комплекса захвата сродства 1, о чем свидетельствует обширный объем работы производимой нами и более широким научным сообществом 7,9,11,18,19,21 -23. Поддерживающие результаты представлены на рисунке 1.
Коллекция предостережений и соображений , применимых к выполнению эффективных экспериментов захвата сродства можно найти в ссылке 1. Как правило , этот подход является наиболее целесообразным: (I) каталогизировать interactors белка интереса, то есть, использовать белок масс – спектрометрии (MS) , чтобы идентифицировать неизвестные ранее copurifying белки (Поисковый анализ); (II) , анализ на присутствие конкретного взаимодействующего партнера, то есть, использовать MS или вестерн – блот для определения конкретного белка или ограниченный набор белков , подозреваемое вствлять с представляющим интерес белком (проверка гипотез); или (III) готовят эндогенно собранные белковые комплексы, содержащие белок, представляющий интерес для дальнейшего изучения с помощью дополнительных методов (препаративный) проработки. Прежде чем приступать к сродства захвата экспериментального режима абсолютно необходимо, чтобы иметь сродство реагента высокого качества, который связывается с белком-мишенью, обычно это IP-компетентны антитела против нативного белка-мишени интереса или по отношению к метке, приложенном к слитого белка. Также важно иметь соответствующие методы экспериментального считывания на месте: общее окрашивание белка (например, Кумасси синим, Sypro Ruby, или серебро, следуя SDS-PAGE), вестерн-блоттинга и белка MS все обычно используемые в сочетании с сродства захвата 1. Представленные протоколы используют антитела, конъюгированного магнитные гранулы в качестве аффинного среды. В то время как функция аффинной среды первоначально может быть подтверждено при проведении испытаний, которые используют несколько экспериментальных параметров, чтобыполучить наилучшие результаты каждого эксперимента должны быть эмпирически оптимизированы 1,11,24. Протоколы разделены на три отличительные фазы: (1) Получение замороженного клеточного материала; (2) поломка ячейки твердотельным размола при криогенной температуре; и (3) экстракции белка и захвата сродства с использованием антител связью парамагнитные шарики.
Эти три протокола работают в тандеме, чтобы (1) подготовить клетки для твердотельного поломки по cryomilling, (2) достичь поломки в планетарной шаровой мельнице, и (3) производят экстракты из порошка клеток аффинной захватить интерес белок в комплексе с его физиологические interactors. Существует много различных методов лизиса клеток, в том числе с применением механических / физических подходов , использующих сокрушительного удара, механические ножницы, и / или давления, а также химических / ферментативных подходов, каждый с различными плюсы и минусы 49,50. Каждый исследователь предлагается изучить методы , наиболее подходящих для их анализа, имея в виду , что любой выбранный подход к разрушению клеток и экстракции белка, вероятно, ввести уклоны 51,52 , требующими эмпирической оптимизации (обсуждается ниже). Механические методы могут производить высокую температуру и / или сдвигающие силы, которые могут разрушить белковые комплексы. Cryomilling избегает эффектов нагревания в силу использования LN 2 охлаждения образцов для тон длительность процесса. Планетарные шаровые мельницы понимаются полагаться на воздействия и силы трения, в том числе напряжения сдвига, как компоненты уменьшения размера частиц 53,54. В настройках сообщили мы не наблюдали дегенерацию белковых комплексов. Действительно , мы извлекли и извлекаются по- видимому , интактные 50 ~ МДА ядерных пор комплексы 11 и ферментативно активные ретротранспозоны , обладающие большей удельной активностью , чем препараты , использующих "нежный" моющее средство на основе лизис 7. Химические / ферментативные методы лизиса клеток , страдают от ограничений , что содержимое клетки выбрасываются в в пробирке среды , которая поддерживает разрушение клеточных мембран и структурных макромолекул , но не могут быть пригодны для поддержания целостности белкового комплекса (ES ) представляет интерес. Часто, ни составляющих комплексов не образуются с интересующим белком, ни условий, необходимых для стабилизации целевые комплексыизвестны заранее. Основным преимуществом твердотельных размола является то, что поломки и извлечение расцепкой, что позволяет исходный материал, который будет подготовлен бесплатно добавленной жидкости, хранить (при -80 ° С или ниже), накопил, и удобно извлекать для экспериментов по требованию; например, изучить оптимизированные в лабораторных условиях для аффинного захвата. Белковое взаимодействие наиболее стабильны при высокой концентрации 55,56, следовательно , свести к минимуму объем экстрагента может быть полезным для сохранения физиологических взаимодействий. С другой стороны, существуют практические соображения – белковые комплексы действительно должны быть разделены из клеток и в невязкой водной фазы, свободной от нерастворимых агрегатов, для того, чтобы смешаться целевые комплексы с аффинной среды. Кроме того, некоторые стандартизация и контроль за экстракорпоральное среды (рН, концентрации соли и т.д.) необходим для систематизации и воспроизводимости. Мы находим, что экстракты прoduced в диапазоне разбавления 1: 4-1: 9 (вес: v) удовлетворяют практические и теоретические проблемы, дающие качественные результаты. Кроме того, оптимальное соотношение экстракта клеток аффинной средних должна быть определена. Это делается эмпирически путем титрования экстрактов с различными количествами аффинной среды и может иметь обнаруживаемые эффекты от отношения сигнал-шум эксперимента, обсуждается ниже. Отличным истощение белка-мишени, как правило, ≥70% от растворимой фракции белка-мишени, но> 90%, желательно и может быть достижима при тщательном параметризацию условий экстракции. Многие такие практические соображения , рассматриваются в качестве ссылки 1. Парамагнитные шарики манипулируют с использованием неодимовых магнитов в специальном держателе микроцентрифужных трубки, хотя домашние альтернативы жизнеспособны. При размещении в держателе, бусы собирают на стороне трубки под действием магнитного поля. Растворы могут затем быть удалены без диsturbing бусы.
Одно ограничение представленного протокола cryomilling, разработанный с планетарной шаровой мельнице , используемой здесь (см Таблицу материалов), является то , что минимальное количество материала требуется для эффективной мельницы и восстановить порошок клеток с помощью этого устройства (> 1 г). Такие величины легко получить с большим количеством микробов, клеточных линий, а также модельных организмов, и могут также часто быть достигнуто с тканями, вырезанных из лабораторных животных. Тем не менее, некоторые клеточные линии могут быть очень трудно выращивать в изобилии и животных тканях может быть дефицитным. Небольшие количества материала могут быть сравнительно измельчали с помощью других устройств, использующих контейнеры меньшего размера, хотя потенциально в жертву порошка мелкости достигнута. Кроме того, стоимость механического размола устройств могут быть слишком дорогими для некоторых лабораторий. Cryomilling может быть достигнуто с помощью ряда альтернативных установок 14-19, в том числе, наиболее доступной цене вручную с помощью вредителяле и миномета, хотя эффективность поломки значительно снижается. Affinity протоколы захвата, как правило, направлены на высокую эффективность лизиса клеток, чтобы облегчить максимальное извлечение белка в растворе и, следовательно, максимальный потенциал для захвата целевых белковых комплексов. С другой стороны, было показано , для дрожжей в пробирке сплайсинга экстрактов , что максимальная лизис не может приравнять с максимальным экстракорпорального биохимической активности 57,58. Мы не наблюдали таких проблем в системах, которые мы тестировали до сих пор, и поэтому целенаправленно не ограничивают нашу клеточную поломку при cryomilling. Тем не менее, такая возможность , следует иметь в виду при оптимизации для ферментативных анализов в лабораторных условиях . Хотя cryomilling является весьма эффективным методом для разрушения клеток, ограниченное количество озвучивания часто приносит пользу производства однородных целых клеточных экстрактов из тканей млекопитающих, так как неоднородные агрегаты иногда могут наблюдаться при визуальном осмотре: как правило,в условиях экстракции с использованием низкой до умеренной соли (100-300 мм) и неионогенного детергента (0,1-1% об / об) концентрации. Поскольку мы наблюдали, что присутствие этих агрегатов может снизить урожайность и / или качество последующего захвата сродства, мы обычно осуществить ультразвуковую обработку, чтобы рассеять их (даже если они не наблюдали невооруженным глазом). Эти агрегаты соответствуют агломерированных фрагментов мембраны, сопоставимые с теми , которых ранее сообщалось в экстрактах из измельченных дрожжевых клеток 58. Ультразвуком также используется в некоторых протоколах к сдвиговым ДНК и высвобождать фрагменты хроматина в раствор, однако степень озвучивания применяется в этом протоколе не заметно фрагмент ДНК. Ограниченная доступность (или высокая стоимость) превосходного аффинного лиганда или антитела против конкретного интересующего белка может стать еще одним препятствием. Широкий спектр коммерчески доступных аффинных реагентов могут быть использованы, когда модель организма поддается геномного мечения или трansfection с внематочной векторы экспрессии, разрешающих экспрессию белков, представляющих интерес как аффинная меченных слитых. Тем не менее, производство заказных антител становится все более возможным и как поликлональные, так и моноклональные антитела могут выполнять превосходно в аффинных приложений для захвата. Эти много соображений , также рассматриваются более подробно в ссылке 1.
Примеры того , как метод лизиса клеток и выбор аффинной среды могут влиять на результаты анализа показаны на рисунке 1. Примеры эффектов , оказываемого различными экстрагентов можно увидеть в ссылках 1,11,24. Поскольку эти и другие экспериментальные параметры влияют на качество захвата сродства, что делает его трудно различить FPs, хранилищами "Борт протеомов" и вычислительных методов для устранения неспецифические примеси были разработаны с целью оказания помощи в выявлении Fps 40-43. Тем не менее, такие подходы только substitЮт для оптимальной подготовки проб в ограниченной степени 59. Соблюдение наилучшей практики и опытным путем оптимизации эксперимента захвата сродства обеспечит самые высокие образцы качества для последующих анализов, обсуждается ниже. Легко реализуется практика, которая может улучшить чистоту образца является родным элюирования. Родной элюирование наиболее часто используется для получения аффинной белкового изолята комплекс, неповрежденную, для дальнейших экспериментов; но, как это часто повышает чистоту образца, он также может быть использован только по этой причине. Тем не менее, как показано на фиг.1, панель II, способность нативного элюции улучшить образец чистоты , может зависеть от точного титрования количества аффинной среды к обилию целевого белка в экстракте клеток – когда среда находится в избытке , незанятые paratopes может разрешить офф-мишени накопление FP белков, наблюдаемых в изначально элюированных фракций. С использованием реагентов и процедур, описанных здесь, это ча наш опыт показал, что единственный наибольший вклад ФПС в наших опытах является меченый белок сам по себе, как только удаляется из контекста живой клетки. (Рис. 1.II и рис. S1). В таких случаях система родительского контроля клеточной линии, которые дают нерелевантные протеомов в отсутствие антигена, не имеют практического значения; Точно так же для тегов или только спайкоподобных в контрольной группе, которые лишены ничего, кроме антигена-мишени. Поэтому, когда мы реализуем практические I-DIRT 7,38, который непосредственно измеряет накопление после лизиса белковых взаимодействий с использованием количественных MS. Как уже упоминалось в пункте 3.2.7 протокола, процедуры для нативного элюирования будет изменяться в зависимости от конкретных деталей системы, используемой сродства. Родной элюирование обычно достигается за счет конкурентного вытеснения меченого белкового комплекса или протеолитическим расщеплением тега, отпуская комплекс из аффинной среды. Несколько систем сродства состоят из небольших тегов эпитопными существуют, FOR , который сам по себе эпитоп доступен как пептид , применимый для конкурентного элюирования меченых белковых комплексов 60. Кроме того, несколько протеаз доступны специфически расщепляют сайты родственных стратегически расположенных в сродства меченой слитые белки 61. В зависимости от специфики выбранных систем сродства, соответствующая схема элюирование может быть принят.
В целом, качество полученных результатов, будут в значительной степени зависеть от качества приготовления образца. Важно тщательно и точно работать через каждый шаг этих протоколов, и как можно быстрее, сохраняя при этом точно и аккуратно. Желательно, чтобы отслеживать разбиение интересующего белка через каждый шаг, чтобы понять эффективность каждой манипуляции. Например: как обильное является белка в клетке или ткани, о котором идет речь? Возможно, этот белок при исследовании (и его комплексов) будет сложно охарактеризовать по массеспектрометрия из-за низкой численности. Если очищенные комплексы могут быть обнаружены с помощью общего окрашивания белка (примерно нанограмм диапазоне), масс-спектрометрия, скорее всего, удастся. Если захваченный интерес белок может быть обнаружен только чувствительной повышенной хемилюминесценции вестерн-блоттинга (приблизительно пикограмм диапазон), масс-спектрометрия, менее вероятно, чтобы быть эффективными. Даже если интерес белок в изобилии в клетке, как в изобилии он в клеточном экстракте Произведенный? Имеет ли раздел белка в растворе, или это в осадке? Если последнее, новое решение экстракции может быть разработана, что может улучшить восстановление. После того, как экстракт клеток в сочетании с аффинной среды, как эффективно улавливается белок? Есть ли белок остаются связанными последующими промывками? А как насчет других copurifying белков? Сохраняя аликвоты каждого образца при соответствующих шагов протокола эти вопросы легко можно ответить, как правило, с помощью вестерн-блоттинга против белка, представляющего интересили общего белка окрашивания, но и другие анализы могут быть также пригодны. Оптимизация каждый шаг будет способствовать повышению урожайности и чистоты захваченных комплексов, хотя может быть компромисс, чтобы быть в максимизации одного атрибута или другого.
Типичное применение сродства захвата для многих исследователей заключается в определении кандидата в естественных условиях interactors для небольшого количества белков , представляющих интерес; эти кандидаты, как правило , подвергают проверке ортогональными подходов в естественных условиях , чтобы продемонстрировать биологическое значение физических interactors. Affinity захвата также применяется в исследованиях с высокой пропускной способностью генерировать списки copurifying белков , наблюдаемых на (почти) протеома масштабе всей, что облегчает вычислительные выводы относительно предполагаемого в естественных комплексов. Многочисленные примеры таких исследований можно найти в литературе. Такой подход отказывается от оптимизации условий захвата для любой цели в пользу изучения человекау цели; как таковой, предполагаемыми комплексы сами по себе редко извлекаются полностью неповрежденным и высокой степенью чистоты в любом данном образце. Скорее всего , частичные совпадения в композициях , наблюдаемых между многочисленными различными аффинно захваченный образцов используют в качестве основы из выводов 42. Оба подхода способствуют ценные данные для понимания интерактома. Тем не менее, одним из основных преимуществ сродства захвата является то, что она часто предлагают возможность получить комплексы неповрежденными и высокоочищенные, при условии, что усилия по оптимизации процедуры. Мы считаем , что будущее подхода заключается в повышении легкость и эффективность оптимизации захвата эндогенных белковых комплексов 11, для более точной оценки цветового охвата физиологических interactors и более частого использования в дальнейшем вниз по течению биохимических, энзимологических и структурных исследований, например, ссылается на 7,9,23.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора Брайана Т. Хаит за его неоценимые советы, поддержку и доступ к MS-измерительных приборов, а также г-жа Келли Р. Моллой за отличную техническую поддержку. Мы благодарим г-жу Келли Bare за поддержку при редактировании копии. Эта работа была частично поддержана NIH гранты P41GM109824, P41GM103314 и P50GM107632.
Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
Extractant | For affinity capture (III) | ||
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
DTT | For affinity capture (III) | ||
SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
Protein Stain | For affinity capture (III) |