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Biochemistry

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Published: December 09, 2016
doi:
10.3791/54518
, ,
1Laboratory of Cellular and Structural Biology,The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,New York University School of Medicine

Summary

Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati.

Abstract

cattura Affinity è una tecnica efficace per isolare i complessi proteici endogeni per ulteriori studi. Quando utilizzato in combinazione con un anticorpo, questa tecnica viene spesso indicato come immunoprecipitazione. cattura affinità può essere applicato in un banco scala e in un contesto ad alta produttività. Quando accoppiata alla spettrometria di massa proteica, cattura affinità ha dimostrato di essere un cavallo di lavoro di analisi interattoma. Anche se ci sono potenzialmente molti modi per eseguire le numerose fasi, i seguenti protocolli di implementare i nostri metodi favorite. Due caratteristiche sono distintive: l'uso di polvere cellule cryomilled per produrre estratti cellulari e perline paramagnetici anticorpi accoppiati come mezzo affinità. In molti casi, abbiamo ottenuto risultati superiori a quelli ottenuti con altre pratiche cattura affinità convenzionali. Cryomilling evita numerosi problemi associati con altre forme di rottura delle cellule. Esso fornisce efficiente rottura del materiale, evitando denatproblemi confi- connessi con il riscaldamento o la formazione di schiuma. Si mantiene il nativo proteina concentrazione fino al punto di estrazione, mitigare la dissociazione macromolecolare. Si riduce il tempo di proteine ​​estratte passano in soluzione, limitando le attività enzimatiche deleteri, e può ridurre l'adsorbimento non specifico di proteine ​​dal mezzo affinità. Micron scala supporti magnetici affinità sono diventati più comuni negli ultimi anni, sempre più sostituendo la agarose- tradizionale e multimediale Sepharose-based. I vantaggi principali di supporti magnetici includono tipicamente inferiore adsorbimento di proteine ​​non specifico; nessun limite di dimensione di esclusione a causa di legame complesso proteico avviene sulla superficie tallone piuttosto che all'interno i pori; e facilità di manipolazione e movimentazione con magneti.

Introduction

Una tipica applicazione delle procedure presentate è di stabilizzare ed ottenere un alto rendimento e la purezza di complessi proteici endogeni di interesse per la caratterizzazione interactomic 1. Resta inteso che le reti dinamiche di entrambi i complessi macromolecolari stabilmente e transitoriamente associati, principalmente costituiti da proteine, orchestrano processi cellulari 2,3. Mentre ci sono molti approcci sperimentali per identificare interazioni proteina-proteina, la cattura affinità è tra i metodi più utilizzati per isolare e sezionare complessi proteici fisiologici 4-6. Inoltre, questa tecnica ha il vantaggio di produrre complessi macromolecolari come entità fisiche, non solo come punti di dati in una lettura-out; vantaggiosamente, i complessi ottenuti possono quindi essere utilizzati in una serie di ulteriori biochimica valle, enzimatica e analisi strutturali 7-9. I protocolli presentati sono stati sviluppati in risposta alla necessità di mappare Proteireti di interazione n-proteine ​​e complessi macromolecolari caratterizzano nel loro ruolo di molecole effettrici della biologia cellulare. Essi sono dettagliate rispetto alla loro applicazione alle cellule di mammifero in coltura tissutale, ma sono ugualmente applicabili ad una vasta gamma di campioni biologici di adeguata ritocchi specifici del sistema.

La storia della cattura affinità risale ai primi anni del XX secolo, con i primi esperimenti di immunoaffinità cromatografia – simile a quello che viene comunemente definito oggi come immunoprecipitazione (IP) – che figurano nella letteratura dei primi anni 1950. Uso tradizionale della tecnica ulteriormente sviluppato attraverso la fine di questo secolo ad oggi 10-13. Diverse cellule e gli studi di biologia molecolare hanno utilizzato la rottura meccanica delle cellule mediante fresatura a temperature criogeniche per almeno gli ultimi quarant'anni 14-19; e separazioni molecolari che utilizzano (super) perline paramagnetici hanno become sempre più comune nel corso degli ultimi due decenni 20. La combinazione di queste diverse tecnologie è servito per migliorare sinergicamente i risultati che possono essere ottenuti in esperimenti di proteine di cattura affinità complesso 1, come evidenziato da un ampio corpus di lavoro prodotto da noi stessi e la comunità di ricerca più ampia 7,9,11,18,19,21 -23. Risultati di supporto sono presentati in Figura 1.

Una raccolta di avvertimenti e considerazioni applicabili all'esecuzione efficaci esperimenti di cattura affinità può essere trovato in riferimento 1. Tipicamente questo approccio è più appropriato per: (I) catalogare i interattori di una proteina di interesse, cioè, usare la spettrometria di massa proteica (MS) per identificare le proteine finora sconosciute copurifying (analisi esplorativa); (II) Test per la presenza di un partner particolare interagente, cioè utilizzare MS o western blot per rilevare una particolare proteina o insieme limitato di proteine sospetta ininteragire con la proteina di interesse (test di ipotesi); o (III) preparare complessi proteici endogeno assemblati contenenti la proteina di interesse per un ulteriore studio di tecniche aggiuntive (iter preparativo). Prima di intraprendere un regime sperimentale di cattura affinità è assolutamente essenziale per avere un reagente affinità di alta qualità che si lega alla proteina bersaglio, in genere un anticorpo IP-competente contro la proteina bersaglio nativo di interesse o contro una etichetta assegnata ad una proteina di fusione. E 'anche fondamentale disporre di metodi appropriati di lettura sperimentale in atto: la colorazione delle proteine ​​generale (come Coomassie blu, Sypro Ruby, o argento, a seguito di SDS-PAGE), western blotting, e proteine ​​MS sono tutti comunemente usati in combinazione con la cattura affinità 1. I protocolli presentati utilizzano biglie magnetiche coniugate anticorpi come mezzo affinità. Mentre la funzione del mezzo di affinità può inizialmente essere convalidato in prove che utilizzano alcuni parametri sperimentali, adottenere i migliori risultati di ogni esperimento dovrebbe essere empiricamente ottimizzato 1,11,24. I protocolli sono separati in tre fasi distinte: (1) preparazione di materiale cellulare congelati; (2) la rottura delle cellule mediante fresatura stato solido a temperatura criogenica; e (3) estrazione di proteine ​​e la cattura affinità con perline paramagnetici anticorpi accoppiati.

Protocol

1. raccolta di cellule e congelamento Grow 1-8 g di materiale cellulare utilizzando le condizioni di coltura appropriate per la linea cellulare di interesse 25,26. Questo protocollo è ottimizzato per un massimo di 8 grammi di cellule (~ 10 9 celle), modificati dai riferimenti 19,27,28. In genere, ~ 5 g di cellule HEK-293 o HeLa può essere ottenuto da otto a 500 piastre di cm 2 di coltura cresciuta fino a ~ 90% di confluenza. ATTENZIONE: Questi protocolli utilizzano azoto liquido (LN 2), in grado di causare gravi ustioni criogeniche. indumenti protettivi Don e adeguato esercizio precauzioni d'uso. Eliminare il terreno di crescita (rifiuti) in un grande bicchiere. Porre la capsula cultura sul ghiaccio in una grande padella di ghiaccio di forma rettangolare. Aggiungere 20 ml di ghiacciata 1x tampone fosfato (PBS) al piatto cultura e rilasciare le cellule dal piatto con un grande raschietto cellulare; trasferire le cellule in una provetta da 50 ml, pre-raffreddata in ghiaccio; tenere la provetta in ghiaccio. NOTA: Per tutti cella fasi di manipolazione utilizzano un set elettro-pipetta a "basso" e 25 ml pipette per evitare un eccessivo taglio delle cellule durante le manipolazioni di trasferimento. Disporre 50 ml provette per il prelievo e la PBS 1X in un secchio di ghiaccio prima di iniziare la procedura. Aggiungere un ulteriore 10 ml di ghiacciata PBS 1x per lo stesso piatto. Raccogliere le cellule rimanenti e trasferirli al tubo 50 ml. Ripetere l'operazione per ogni piatto; sospensioni cellulari da diversi piatti possono essere combinati per ridurre il numero del campione e rifiuti di plastica. NOTA: Poiché le cellule stesse non costituiscono una gran parte del volume di sospensione, tre lastre valore di sospensione cellulare possono essere combinati in due provette da 50 ml. Perché provette da 50 ml in realtà detengono più del volume nominale, otto piastre in genere può essere distribuiti su cinque di questi tubi. Centrifugare per 5 min a 1000 xg, 4 ° C. Versare con cautela il surnatante. Risospendere ogni pellet in 10 ml ghiacciata PBS 1x. Consolidare il Resupellet trascorsa, fino al 5 per tubo da 50 ml, per ridurre il numero del campione. Centrifugare 5 min a 1000 xg, 4 ° C. Versare con cautela il surnatante. Risospendere il pellet in 10 ml ghiacciata PBS 1x Rimuovere lo stantuffo da una siringa da 20 ml e metterlo da parte. Cap l'ugello della siringa e trasferire la sospensione cellulare ad esso. Posizionare la siringa all'interno di un tubo da 50 ml e centrifugare 5 min a 1000 xg, a 4 ° C. Aspirare il surnatante con una multa pipetta punta collegata ad un sistema di cattura sotto vuoto fino a poco lo strato superiore delle cellule comincia a essere aspirato. Ciò si traduce in un pellet di cellule bagnato. Stappare la siringa, inserire il pistone e sgocciolare le cellule direttamente in un grande bicchiere di plastica pieno di LN 2, tenuto in un bagno di LN 2 in una scatola di polistirolo. Forzatamente immergere le cellule rimanenti dalla siringa. Trasferire le cellule congelate per tubi da 50 ml versando. Liberamente tappare i tubi per consentire eccesso LN 2 evaporare; tenere torlo notte a -80 ° C. Serrare i tappi completamente il giorno successivo. La cella congelata può essere memorizzato in questo modo a -80 ° C fino cryomilling. NOTA: Non chiudere ermeticamente i tubi prima di tutto il LN 2 è visibilmente evaporato, altrimenti la pressione eccessiva può causare il tubo di esplodere. Non chiudere le valvole dopo che l'LN 2 è dissipata può causare l'accumulo di brina sul materiale cellule, aggiungendo peso dell'acqua in eccesso e ridurre efficacemente la concentrazione di proteine su fresatura. 2. Perturbazioni criogenico di cellule congelate NOTA: Tutti gli strumenti per la fresatura e le manipolazioni devono essere pre-raffreddati con LN 2. Un piccolo decanter sarà richiesto per l'aggiunta LN 2 all'interno del vaso e per versare LN 2 sopra la parte superiore del barattolo fresatura chiuso. Uno strumento fatto in casa è mostrato in riferimento 19. Saranno necessari guanti criogenici per gestire la LN 2 raffreddato apparecchi fresatura. la fresaturacoperchi di vaso usate qui (vedi tabella dei materiali) di solito viene fornito con una guarnizione di gomma installato; questo dovrà essere sostituito con un coperchio Teflon guarnizione disponibile in commercio per eseguire in modo affidabile il seguente protocollo. Inoltre, perché la pressione da N gassosa 2 può costruire fino a livelli elevati all'interno del vaso durante la fresatura, si consiglia di installare un / 500 valvola di pressione disponibile in commercio 5 bar kPa come precauzione di sgancio di sicurezza 28. Rimuovere perline di cellule dallo stoccaggio -80 ° C e mantenere in un supporto di tubo da 50 ml in un bagno LN 2. Pre-raffreddare il vaso 50 ml, due 20 palle mm, e il coperchio in un secchio di ghiaccio di forma rettangolare pulita contenente LN 2. Pre-raffreddare il (PTFE) isolante Politetrafluoroetilene se utilizza uno; o un insieme di puck (vedi riferimento 27), o di un manicotto-and-puck (vedi figura 2). Pre-raffreddamento è completa quando l'ebollizione violenta di LN 2 calma. Situato contrappeso appropriato sullamulino. NOTA: Questo sarà uguale alla massa del vaso, coperchio vaso, le sfere di macinazione in uso, e la quantità di cellule da aggiungere al barattolo. Se si utilizzano qualsiasi isolatori in PTFE, la loro massa dovrebbe essere inclusa. Si consiglia di registrare le masse del vaso, coperchio, e le sfere (e loro massa combinata, comprese eventuali isolante utilizzato) in anticipo e registrazione su un foglio informativo memorizzato nei pressi del mulino. Utilizzando pinze, posizionare le due sfere 20 mm di fresatura pre-raffreddati e le cellule congelate all'interno del vaso di pre-raffreddamento fresatura. Nota: A causa di piccole perdite di materiale sulle superfici vaso e sfera durante la fresatura, aumenta la percentuale di materiale recuperato come la massa delle cellule aumenta lavorato. Con il metodo descritto, perdite materiali sono molto modesti, essendo dell'ordine di ~ 0,3 g di peso cella umida (WCW). linee guida del produttore indicano il volume massimo di campione caricato dovrebbe essere ~ 1/3 del volume di vaso. 29 Il volume totale delle sfere dovrebbe essere ~ 1/3 e remaining ~ 1/3 di spazio libero è per la libera circolazione delle sfere. Aggiungere LN 2 al barattolo fino a ~ ½ piena, posizionare il coperchio sul vaso e trasferire il gruppo al mulino. NOTA: Per prima cosa installare dell'isolante prescelto se si utilizza uno. Bloccare l'assemblea nel luogo e di eseguire tre cicli di fresatura utilizzando il programma seguente: 400 rpm, 3 minuti, ogni minuto, nessuna rottura intervallo di reverse-rotazione. Raffreddare il vaso di fresatura con LN 2 tra ogni ciclo. NOTA: Durante la fresatura di una rumore clunking distinta è generato come le palle si scontrano all'interno del vaso in moto planetario. Se questi suoni non si sentono, fresatura, non si sta verificando. Termina il ciclo di fresatura, non contano questo ciclo, spostare il gruppo barattolo torna a LN 2 ed esaminare il contenuto del barattolo. Garantire l'assenza di ghiaccio si è formato e se ha, Chip It lontano dalle pareti del vaso con una spatola di pre-raffreddamento. Ricominciare dal punto 2.5. Se non per mezzo di isolatori o isolanti dischi di gomma, spostare il gruppo barattolo torna a LN <sub> 2 tra i cicli di ri-raffreddare e aggiungere LN 2 a ~ ½ pieno ogni volta. La LN 2 aggiunto evapora all'interno del vaso come la temperatura degli aumenti vaso durante la macinazione. Questo si traduce in accumulo di pressione all'interno del vaso. Pertanto, quando il vaso disimpegno dal mulino, allentare il blocco molto lentamente. Se il morsetto viene rilasciato rapidamente, polvere di cella può scappare con una rapida depressurizzazione. Un lento rilascio della pinza permette la pressione di fuggire dal vaso in un dolce, modo controllato, e previene la perdita di materiale cellulare. La fuga dolce N gassosa 2 può spesso essere sentito sibilando come la pinza viene rilasciato lentamente – questo è normale. Se si utilizza un isolatore manicotto-e-puck, il gruppo barattolo può essere lasciato nel mulino e LN 2 aggiunto al gruppo isolatore / vaso in situ. Spostare il vaso torna a LN 2, e lasciate riposare un attimo a raffreddare. Se si utilizza un isolatore manicotto-e-puck, il vaso può essere rimosso dal manicotto won l'aiuto di due spatole, fornendo leva su entrambi i lati. Una volta che il vaso si riposa in LN 2, rimuovere con attenzione il coperchio, rimuovere le palle con pinze, e trasferire la polvere ad un tubo di pre-raffreddamento da 50 ml con una spatola di pre-raffreddamento. L'aggiunta di un po 'di LN 2 all'aperto vaso / polvere può aiutare a rimuovere la polvere che si è incrostata le palle, prima di rimuoverli. NOTA: Una volta che il vaso è stato aperto, aggiungere una piccola quantità di LN 2 ad esso prima di rimuovere le palle. Questo aiuterà a recuperare la polvere incrostata sulle superfici. Polvere cellulare dovrebbe essere tenuto a -80 ° C o al di sotto fino al momento dell'uso. Nella nostra esperienza, polvere di cella può essere memorizzato in questo modo, sostanzialmente indefinito, senza compromettere le prestazioni. 3. Affinità cattura di complessi proteici da estratti cellulari NOTA: Il seguente protocollo implementa mezzi affinità costituiti da un legante di affinità, esche, o anticorpi che interagiscono con la proteina di interesse, coupled al micron scala perline paramagnetiche. Questi possono essere preparati in casa 19,30, utilizzando kit disponibili in commercio, o acquistati come reagenti ready-made. Preparazione delle cellule Estratto NOTA: Quando si maneggia la polvere delle cellule, ricordatevi di usare utensili e tubi pre-raffreddati con LN 2. Provette contenenti la polvere di cellule devono sempre essere tenute in LN 2 quando non è a -80 ° C. Posizionare il tubo 50 ml (s) contenente polvere di cella in un rack tubo, in un contenitore polistirolo con LN 2. Pesare 100 mg di polvere di cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 o 2 ml. NOTA: Abbiamo osservato che questa quantità di cellule è un buon punto di partenza che in genere produrrà la proteina bersaglio in decine a centinaia di nanogrammi varia dopo la cattura affinità per una proteina moderatamente espresso (~ 50 massa kDa, presente in migliaia di copie per cell), presumendo che l'estrazione e cattura l'efficienza del target sono ≳70%. Tali rendimenti prevedono visualiz direttazione della frazione purificata mediante SDS-PAGE e colorazione delle proteine. bilancia analitica tara con la provetta per microcentrifuga vuota. Distribuire la polvere delle cellule in una provetta utilizzando un LN 2 raffreddato cucchiaio o una spatola. Controllare la massa della polvere erogata all'interno del tubo sulla bilancia analitica. NOTA: Per facilitare la pesatura di polveri cellulari, possono essere utilizzati cucchiaini di misura volumetrici. Questi sono stati trovati a dare risultati riproducibili (vedi riferimento 19). Abbiamo trovato i migliori risultati con tappo a vite o microprovette 'Safe-Lock. Pressione evaporazione LN 2 che possono immettere i tubi possono causare provette da microcentrifuga standard per appaiano aperto durante la successiva riscaldamento appena prima dell'aggiunta della soluzione di estrazione – potenzialmente con conseguente perdita del campione. Aprire il tubo (o allentare tappo a vite) con polvere di cellule e lasciate riposare a temperatura ambiente per 1 min. Questo rilascerà la pressione all'interno del tubo ed evitare il congelamento immediato dell'estrazionesoluzione quando aggiunto alla polvere. Non scongelamento si osserva durante questo 1 min di incubazione. Aggiungere 400 ml di estraente integrato con inibitori della proteasi e vortex brevemente, quindi tenere sul ghiaccio mentre si procede al passo 3.1.5. I campioni devono essere tenuti in ghiaccio tra tutte le manipolazioni successive fino a eluizione. NOTA: La composizione ottimale del solvente dipenderà complesso proteico (es) da depurare. Alcune linee guida generali è fornita nella tabella 1 ei riferimenti di supporto. Utilizzare un ultrasonicatore microtip per dare l'esempio di un breve impulso a bassa energia per disperdere eventuali aggregati. (Ultra) ultrasuoni con 4 impulsi (2 secondi ciascuno, 2 A; circa il 15-20 J di energia totale). NOTA: vortex eroga la polvere cellula nel solvente, ma a seconda del carattere soluzione, si può osservare alcuni aggregati. Abbiamo trovato che la dispersione questi aggregati prevede la miglior resa durante la successiva acquisizione affinità. Una breve microtip sonicazione disperde facilmente questi aggregati. La soluzione deve apparire semi-trasparente, ma omogenea, senza evidenti aggregati. sonicatori bagnomaria tendono ad essere troppo bassa potenza per disperdere efficacemente tali aggregati senza tempi di manipolazione del campione significativamente più lunghi, ma possono essere adatti con le impostazioni appropriate. Chiarire l'estratto per centrifugazione (ad esempio, 20.000 xg, 10 min, 4 ° C). NOTA: Una aliquota di estratto cellulare chiarificato può essere salvato per il confronto con il contenuto del pellet, il post-affinità cattura surnatante, e le frazioni ottenute dopo eluizione dal mezzo affinità per determinare l'efficienza di estrazione e la cattura della proteina bersaglio , ad esempio, da Western blot (vedi la discussione). Rimuovere il surnatante (estratto chiarificato) e procedere alla cattura affinità. NOTA: Il pellet può essere ri-estratto in SDS-PAGE tampone di caricamento del campione a 70 ° C per determinare il grado di rilascio della proteina bersaglio durante dell'estrazione iniziale non denaturante rispetto all'estratto ottenuto nel passaggio 3.1.6. Cattura Affinity Prelavaggio del mezzo affinità magnetica. Questo può essere fatto mentre estratti cellulari sono stati centrifugati. Posizionare il tubo (s) sul magnete. Le perle si accumulano sul lato del tubo in pochi secondi, permettendo la soluzione di archiviazione da rimuovere. Aggiungere 500 ml di soluzione di estrazione di perline. Brevemente vortex mix a velocità media (sufficienti per sospendere di nuovo). Pulse-spin i tubi in un mini-centrifuga per raccogliere tutti i contenuti verso il basso. Ciò garantisce il riporto minimo di soluzioni. Posizionare tubi sul magnete e aspirare la soluzione. NOTA: i media magnetici con caratteristiche distintive sono disponibili da una vasta gamma di fornitori commerciali. I risultati possono variare a seconda queste caratteristiche, tra cui le dimensioni tallone, l'uniformità, rivestimento di superficie, e la chimica di accoppiamento degli anticorpi. Side-by-siprove de nell'applicazione sono raccomandati prima di stabilirsi su un reagente scelta. Avviare la cattura affinità trasferendo l'estratto cellulare chiarito in una provetta da 1,5-2,0 ml contenente medio affinità pre-lavati e vortex brevemente per sospendere di nuovo. Incubare per 30 minuti a 4 ° C con continua miscelazione delicata su una ruota rotatore; le perline dovrebbero rimanere sospese in tutta l'incubazione. Centrifugare i tubi in un mini-centrifuga per raccogliere tutti i contenuti al fondo della provetta. Aspirare il surnatante e lavare le perline tre volte con 1 ml di soluzione di estrazione a freddo come descritto al punto 3.2.3. Posizionare i tubi sul magnete. Rimuovere la soluzione. Procedete ad aggiungere la soluzione successiva e ripetere. Durante il lavaggio 2 °, trasferire le perline e soluzione di lavaggio insieme ad una provetta per microcentrifuga fresco pipettando. Questo riduce la contaminazione del campione, nel punto di eluizione, da proteine ​​adsorbite casuali alle pareti del tubo utilizzato per l'incubazione con tegli cella estratto. Dopo il lavaggio 3 °, le perline dovrebbero essere brevemente impulsi filata in un mini-centrifuga per raccogliere tutti i contenuti sul fondo. Posizionare il tubo di nuovo sul magnete, e rimuovere ogni residuo di liquido. Ciò consente la rimozione degli ultimi ml di soluzione prima eluizione, garantendo i campioni eluiti avranno volumi uniformi. Essa assicura altresì la eluizione sarà efficace, come la soluzione di eluizione non sarà diluita lavaggio residuo; tali residui possono anche contribuire agli effetti sale e alterare la migrazione delle proteine ​​in SDS-PAGE (vedi sotto). NOTA: Un'aliquota del surnatante post-vincolante può essere salvato per il confronto con l'estratto chiarito generato in 3.1.6. da Western Blot. Il risultato indicherà il grado di esaurimento della proteina bersaglio dall'estratto cellulare. Eluire sia in modo nativo o denaturazione; considerare la strategia migliore per l'applicazione a valle 1. NOTA: I dettagli di Strategie eluizione nativas dipenderà dalla tag affinità utilizzato (vedi la discussione). Per molti utenti, denaturanti eluizione con tampone campione SDS-PAGE seguita da analisi del campione SDS-PAGE con proteine colorazione 31, sarà l'approccio più pratico iniziale. NOTA: La composizione del tampone campione dipenderà dal sistema di elettroforesi in uso. Molti laboratori gettano loro gel Tris-glicina, facendo uso di elettroforesi discontinuo e il sistema tampone Laemmli 32-34. Una ricetta tampone campione comune (1x) comprende: 10% (w / v) di saccarosio, 50 mM DTT, 2% (w / v) di SDS, 62,5 mM Tris-Cl pH 8,8, 0,0004% (w / v) blu di bromofenolo 31 . Vi proponiamo di preparare uno stock 1.1x che omette DTT. 1/10 del volume di 500 mM DTT deve essere aggiunto al campione prima SDS-PAGE (vedi sotto). Molti sistemi SDS-PAGE disponibili in commercio sono disponibili anche; questi possono includere i buffer di campioni specifici del sistema. Aggiungere tampone campione SDS-PAGE senza agente riducente (per mitigare il rilasciodi catene anticorpali dalle perline) e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente con agitazione. NOTA: Questo interferirà con la maggior parte delle interazioni affinità basata, rilasciando le proteine ​​catturate nel supernatante. interazioni più persistenti possono beneficiare di temperatura elevata per il rilascio (in genere 70 ° C è sufficiente). Raccogliere e salvare il surnatante. I campioni possono essere congelati a -20 ° C per brevi stoccaggio (pochi giorni) o -80 ° C per una conservazione prolungata fino al momento dell'analisi è desiderato. Sottoporre i campioni per SDS-PAGE seguita da colorazione delle proteine usando tecniche standard 31. MS può essere utilizzato per caratterizzare la composizione del campione 1. bande proteiche individuali possono essere asportati per l'identificazione o l'intero campione possono essere caratterizzati in una singola analisi elettroforesi campione solo brevemente (4-6 mm nel gel) ed elaborare tutte le proteine ​​nel campione insieme come una 'spina gel.' NOTA: Aggiungere DTT prima iniTing elettroforesi. Se si intende procedere a MS, campioni possono essere alchilati dopo elettroforesi 35; Tuttavia, è spesso più conveniente alchilata prima dell'elettroforesi 36.

Representative Results

Figura 1, pannello I dimostra che cryomilling e sfere magnetiche possono lavorare insieme per migliorare la qualità del campione. Pannelli IA-C dimostrano che il materiale comprendente il mezzo insolubile utilizzato per la cattura affinità può influenzare proteoma recuperato 19. La proteina di interesse, purificato fosfatasi alcalina batterica FLAG-tag (BAP), è stata aggiunta in estratti di cellule umane. BAP non si prevede che interagisca specificamente e copurify proteine ​​umane. La firma di proteine ​​copurifying, giudicati da SDS-PAGE e colorazione Coomassie, varia a seconda del mezzo utilizzato. sfere magnetiche Micron scala mostrato il profilo pulito, indicando un livello relativamente basso di non-specifica adsorbimento di proteine. Pannelli ID e IE illustrano che il metodo di lisi cellulare può anche influire sulla proteoma recuperato. Nell'esempio fornito, un complesso proteina endogena (NEXT complesso 37), è stato sottoposto a captu affinitàre da cellule cyromilled o sonicato estratti 19. Sono stati osservati Meno contaminanti di massa ad alta quando l'estratto di cellule è stato prodotto da polvere di cellule cryomilled. Una sfida quando si utilizza cattura affinità per studiare complessi proteici endogeni è che può essere difficile discriminare bona fide interattori fisiologiche della proteina di interesse da falsi positivi (PQ). PQ può derivare da molte fonti, tra adsorbimento non specifico per tubi e navi, il mezzo affinità, l'anticorpo o di affinità ligando, e / o per la proteina di interesse in sé. Di conseguenza, sforzo significativo deve essere dedicata ad ottimizzare il processo di cattura. La rilevazione dei PQ rimane una sfida centrale per il quale sono stati sviluppati un gran numero di strumenti diversi, tra cui sperimentale 38-40 e computazionale si avvicina 41-43, ciascuno con diversi pro e contro. Nei nostri esperimenti abbiamo già notato un modello di Fproteine ​​P legame, ottenuto dopo incubazione di α-FLAG supporto magnetico con estratti di cellule di controllo, che è stato distinto dal modello ottenuto in presenza di proteine ​​3xFLAG-tag. Inoltre, questi PQ potrebbe essere rilasciato dal mezzo da incubazione con 3xFLAG peptide 7. Questa osservazione è coerente con opportunistica legame PQ al paratope α-FLAG in assenza dell'epitopo cognate. Comprendere la natura di questo fondo FP è importante in quanto molti studi utilizzano un senza tag 'linea cellulare dei genitori' come controllo finto per la cattura affinità; questi controlli possono quindi essere inadeguato per determinare la specificità di interazione con la proteina codificata. Per determinare lo sfondo legame forniti dai nostri media affinità quando paratopes anticorpi sono occupati o no, abbiamo condotto esperimenti di cattura affinità finte utilizzando α-FLAG supporto magnetico e estratti di cellule HEK 293T (nessuna proteina tag espresso) in presenza o in assenza di un 3xFLAGpeptide spike-in. I risultati sono mostrati in Figura 1, pannello II. Brevemente, α-FLAG mezzo magnetico è stata incubata in estratti cellulari (di ≳10 mg / proteine ​​totali ml) contenente 500 mM NaCl e 1% v / v Triton X-100 in 20 mM HEPES-Na pH 7,4 per 30 min. Il mezzo è stato poi incubato con 1 mg / ml 3xFLAG peptide spostare competitivamente eventuali proteine ​​legate alla paratope α-FLAG nativo o con tampone campione SDS-PAGE per ottenere una eluizione denaturazione. Inoltre, lo stesso esperimento è stata effettuata quando le estratti cellulari sono stati addizionati con 1 mg / ml e 10 ug / ml di 3xFLAG peptide. Tutte le frazioni eluite sono stati sottoposti a SDS-PAGE e colorazione argento. Abbiamo osservato che in assenza del suo epitopo cognate, medio α-FLAG non acquisire un livello rilevabile di proteine di fondo che possono essere eluite con 3xFLAG peptide – nell'esempio fornito da Figura 1-II, una specie dominante è stata osservata tra il 37 e 50 kDa. Il pattern eluita contampone campione SDS-PAGE era paragonabile, con specie importanti supplementari. Tuttavia, in presenza di 1 mg / ml 3xFLAG peptide, FP vincolante al mezzo affinità è stata eliminata al di sotto del livello di rilevamento e non è stato osservato sia nei frazioni di eluizione native o denaturanti. Questo risultato suggerisce che non occupate paratopes anticorpo può essere promiscua in assenza del loro epitopo cognate e contribuiscono significativamente proteoma ottenuto durante la cattura affinità anche per gli anticorpi che si legano loro epitopo ad alta affinità, come è il caso per la 3xFLAG / α-FLAG M2 accoppiamento. Inoltre suggestd che condizioni molto severe utilizzando sale alto, spesso scelta per mitigare legame non specifico, possono essere inefficaci in assenza di interazione antigene / anticorpo. Per il follow-up abbiamo effettuato un simile esperimento compresa l'analisi mediante SDS-PAGE e quantitativa MS (Fig. S1). Dei 347 proteine ​​quantificati, abbiamo osservato che ogni proteina salva per un (falso discotecamolto rate = 1%; Tabella S1) è stato associato con la proteina esca 3xFLAG-etichettato rispetto a un peptide 3xFLAG spillo campione di controllo. Questi risultati indicano che nei nostri esperimenti la stragrande maggioranza delle proteine ​​osservate sono suscettibili di co-purificare con la proteina tag o sono fuori bersaglio sottoprodotti di non occupati paratopes α-FLAG. Nella nostra esperienza, i risultati alti segnale-rumore di cattura affinità sono esemplificate in SDS-PAGE e colorazione delle proteine ​​da un modello discreto di bande taglienti, abbondanti e circa stechiometrico, nonché una scarsità di colorazione di fondo da altri gruppi più deboli; numerosi esempio di questo principio può essere visto in riferimento 11. Il motivo per l'utilizzo di un isolante in PTFE (che è consigliato) quando cryomilling è quello di ridurre il tasso di riscaldamento del vaso durante la fresatura, ridurre l'onere di ripetute LN 2 raffreddamento durante il processo di fresatura, e ridurre il grado di ghiaccioformazione nel vaso. Questo facilita prestazioni di fresatura coerenti e facilita la manipolazione della polvere cella. Isolatori Esempi possono essere trovati in riferimento 27 (puck) e descritte nella Figura 2, sotto (manicotto-e-puck). Figura 1: Selezionare Rappresentante dei risultati. (I) Questo pannello è stato modificato dal riferimento 19. Coomassie blu macchiato gel di SDS-poliacrilammide. (SINISTRA) Micron scala magnetica perline mostrano inferiore off-obiettivo vincolante di supporti agarosio-based. (A) sfere magnetiche; (B) agarosio tradizionale; (C) di ferro impregnato (magnetica) agarosio; ogni accoppiato ad anticorpi anti-FLAG M2 e utilizzati per catturare fosfatasi alcalina batterica FLAG-tag (BAP; etichettati) spillo in estratti di prodotti a partire da cryomilled cellule HEK-293. purificazioni agarosio-basedhanno mostrato livelli elevati di adsorbimento non specifico (bande senza etichetta). (a destra) Estratti derivati ​​da cellule HeLa cryomilled mostrano minore adsorbimento fuori bersaglio su sfere magnetiche anticorpi accoppiato rispetto a quelle prodotte mediante ultrasuoni quando viene utilizzato per purificare un complesso proteina endogena. LAP-tagged 44 RBM7 stata affinità catturato utilizzando sfere magnetiche accoppiate ad anticorpi anti-GFP policlonali per purificare NEXT complesso 19,37 (D) estratto prodotto da polvere cryomilled; (E) estratti prodotte mediante ultrasuoni delle cellule intatte. La barra nera verticale evidenzia una regione del gel in cui sono stati osservati alti interattori di massa non specifici ad arricchirsi nel campione preparato mediante ultrasuoni. Le frecce nere indicano i interattori specifici previsti (etichettati). Bande osservati ~ 50 kDa in corsia D ed E sono attribuibili a lama IgG catene pesanti. (II) Argento macchiato gel di SDS-poliacrilammide. (Std.) Una cattura affinità finto effettuata su HEK-293cellule T estratti in modo standard. Dopo la cattura, eluizione del materiale legato è stato ottenuto tramite (N) non denaturazione-eluizione con 1 mg / ml 3xFLAG peptide o (D) denaturazione eluizione in tampone campione SDS-PAGE; (PB 1) Std. ma il peptide 3xFLAG è stato incluso nella soluzione di estrazione a 1 mg / ml per bloccare i paratopes α-bandiera sul mezzo di affinità; (PB 10) come PB 1 ma in presenza di 10 ug / ml 3xFLAG peptide. bande IgG-correlate e 3xFLAG peptide sono etichettati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2: maniche-e-puck PTFE isolante. Viene mostrato un vaso PTFE 250 ml (1). A stainless vaso fresatura di acciaio 50 ml (2) si inserisce all'interno del vaso PTFE (3) e forniscepossibilità di lasciare il barattolo fresatura installato all'interno del mulino tra i cicli. Un puck PTFE isolante superiore (2) viene utilizzato tra il gruppo pinze e il coperchio vaso. Per raffreddare il vaso e isolante quadro installato (3), LN 2 viene aggiunto direttamente nel corpo dell'isolatore, circonda il vaso. Il successivo ciclo di fresatura può quindi essere avviata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Reagente Concentrazione consigliata Note Cloruro di sodio 0,1-0,5 M Concentrazioni elevate (> 300 mm) tendono a migliorare l'estrazione di proteine ​​totali e mantenere sfondo bassa, ma può spogliare un po ', tra l'altro stabileattori. Concentrazioni inferiori a 150 mm, non sono in genere efficaci nel ridurre sfondo non specifico. acetato di ammonio 0,2-2 M Un sale, composto di due buffer, che produce una soluzione pH neutro 57. Concentrazioni più elevate stabilizzare alcuni complessi proteici. soluzioni acide possono derivare da vecchie scorte cristallini non correttamente conservati in seguito a perdita di ammoniaca. N tampone pH aggiuntivo o sali sono necessari estraenti contenenti acetato di ammonio. Può essere combinato con NaCl per modulare i risultati ottenuti. Tween 20 0,1% v / v Un detergente non ionico 58; tipicamente combinato con NaCl. Triton X-100 0.5-1% v / v Un detergente non ionico 58; tipicamente combinato con NaCl o NH 4 CH 3 CO 2 H CHAPS 5 mM Un detergente zwitterionico 58 </ Sup>; tipicamente combinato con NaCl. Sarkosyl 1 mM Un detergente anionico 58 che riduce i background e può togliere componenti complessi stabili, potenzialmente rivelando connettività binario; tipicamente combinato con NaCl. Tris-Cl 20 mm pK a di 8,8 a 4 ° C, 8,1 a 25 ° C. (PH 8,0) HEPES-Na 20 mm pK a di 7,8 a 4 ° C, 7,5 a 25 ° C. NaOH o KOH usata per pH equilibrazione seconda del sale (per esempio, NaCl, KCl, o CH 3 CO 2 K) utilizzato nel solvente. (PH 7.4) Tabella 1: Alcuni suggerito reagenti utile per purificare complessi proteici. Questa tabella lTSI alcuni reagenti che abbiamo trovato utile per purificare complessi proteici da linee cellulari umane, con concentrazioni di lavoro suggerite. Una tipica formulazione solvente contiene un tampone di pH, un sale, e un detergente 1,11,24,45-48. Le migliori pratiche è quello di individuare la combinazione meno complesso di reagenti che produce il risultato desiderato. Figura S1: Mescolare Dopo l'analisi Purificazione (MAP-) SILAC di falsi positivi. I. Schema: In questo esperimento 3xFLAG-tagged complessi proteici ORF2p (espresse da pLD401) sono stati purificati da cellule heavy e light-etichettati HEK-293T 7, rispettivamente. L'estratto cellulare luce etichettata è stata aggiunta una 3xFLAG peptide per evitare affinità cattura del ORF2p 3xFLAG-tag per inibizione competitiva; questo non è previsto per bloccare il legame di proteine ​​che possono verificarsi non specificamente con il mezzo magnetico o le strutture non paratopic dell'anticorpo. Dopo l'eluizione dalle sfere magnetiche, i campioni pesanti e leggeri sono stati misti post-purificazione e analizzato da MS quantitativa (MAP-SILAC 39) per determinare la frazione di proteine associate con entrambi campione; ulteriori dettagli metodologici situato nella Tabella S1. II. Argento macchiato gel illustra che i materiali leggeri e pesanti marcati forniscano risultati comparabili (confrontare L con H), e che la purificazione condotta in presenza del 3xFLAG picco-a (LI) era competitivamente inibita. Sotto, un G-250 spina Coomassie Blu gel colorato costituito dalla H misto e frazioni LI, prima dell'analisi proteomica a base di gel, come descritto nella Tabella S1. Clicca qui per scaricare una versione più grande di questa figura. Tabella S1:MAP-SILAC. Questa scheda contiene i dati ottenuti al momento dell'esecuzione dell'esperimento MAP-SILAC descritto nella figura S1. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Questi tre protocolli lavorano in tandem per (1) preparare le cellule per la rottura a stato solido da cryomilling, (2) ottenere la rottura in un mulino a palle planetario, e (3) producono estratti di polvere cellule all'affinità cattura una proteina di interesse in complesso con i suoi interattori fisiologici. Molte diverse tecniche di lisi delle cellule esistono, tra cui approcci meccaniche / fisiche che impiegano schiacciamento impatto, taglio e / o la pressione, così come chimici / approcci enzimatiche, ognuno con diversi pro e contro 49,50. Ogni ricercatore è incoraggiato ad esplorare metodi più adatti per le loro analisi, tenendo presente che qualsiasi approccio scelto per la rottura delle cellule e l'estrazione di proteine rischia di introdurre distorsioni 51,52 che richiedono ottimizzazione empirica (discusso sotto). metodi meccanici possono produrre calore elevato e / o forze di taglio che possono disturbare complessi proteici. Cryomilling evita effetti di riscaldamento in virtù di impiegare LN 2 raffreddamento dei campioni per tDurata lui del processo. Mulini a sfere planetarie si intendono far valere di impatto e di attrito forze, anche sollecitazione di taglio, come componenti di riduzione delle dimensioni delle particelle 53,54. Alle impostazioni riportato non abbiamo osservato la degenerazione di complessi proteici. Infatti abbiamo estratto e recuperato apparentemente intatti ~ 50 MDA complessi dei pori nucleari 11 e enzimaticamente retrotrasposoni attivi che presentano maggiore attività specifica dalle preparazioni che impiegano 'dolce' lisi detergente a base di 7. Chimico / metodi enzimatici di lisi cellulare soffrono della limitazione che il contenuto della cella vengono rilasciati in una vitro ambiente in grado di supportare la rottura delle membrane cellulari e macromolecole strutturali ma può non essere adatto per mantenimento dell'integrità del complesso proteico (es ) di interesse. Frequentemente, né i componenti dei complessi formati con la proteina di interesse, né le condizioni necessarie per stabilizzare i complessi di destinazione sonoconosciuto in anticipo. Un notevole vantaggio di fresatura a stato solido è che la rottura e l'estrazione sono disaccoppiati, permettendo materiale di partenza per essere preparati senza liquido aggiunto, conservati (a -80 ° C o al di sotto), accumulato, e convenientemente recuperati per la sperimentazione on-demand; ad esempio, per esplorare ottimizzata in condizioni in vitro per la cattura affinità. Interazioni proteina sono più stabili ad alta concentrazione 55,56, pertanto minimizzando il volume di solvente può essere vantaggioso per preservare interazioni fisiologiche. D'altra parte, ci sono considerazioni pratiche – complessi proteici hanno bisogno di essere diviso su cellule e in una fase acquosa non viscoso, privo di aggregati insolubili, per mescolarsi complessi di destinazione con il mezzo affinità. Inoltre, alcuni standardizzazione e controllo sull'ambiente in vitro (pH, concentrazione salina, ecc) è necessario per sistemazione e riproducibilità. Troviamo che estrae produced nella gamma diluizione di 1: 4-1: 9 (w: v) soddisfare le preoccupazioni teoriche e pratiche, ottenendo risultati di qualità. Inoltre, la percentuale ottimale di estratto cellulare all'affinità esigenze medie da determinare. Questo viene fatto empiricamente per titolazione di estratti con quantità variabili di medie affinità e può avere effetti rilevabili sul rapporto segnale-rumore dell'esperimento, ulteriormente di seguito. Un'eccellente deplezione della proteina bersaglio è tipicamente ≥70% della frazione solubile della proteina bersaglio, ma> 90% è desiderabile e può essere realizzabile con accurata parametrizzazione condizioni di estrazione. Molte di queste considerazioni pratiche sono coperti di riferimento 1. perline paramagnetici sono manipolati con magneti al neodimio in un supporto provetta specializzato, anche se le alternative fatte in casa sono vitali. Quando posizionato all'interno del supporto, perline raccolgono al lato del tubo sotto l'influenza del campo magnetico. Le soluzioni possono poi essere rimossi senza disturbing le perline.

Una limitazione del protocollo cryomilling presentato, sviluppato con il mulino a palle planetario qui utilizzato (Vedi Tabella dei Materiali), è che una quantità minima di materiale è necessario per efficacemente mulino e recuperare polvere cella utilizzando questo dispositivo (> 1 g). Tali quantità sono facilmente ottenuti con molti microbi, linee cellulari e organismi modello, e possono spesso essere realizzato con tessuti asportati da animali da laboratorio. Tuttavia, alcune linee cellulari possono essere molto difficili da coltivare nei tessuti abbondanza e animali possono essere scarse. Piccole quantità di materiale può essere paragonabile fresati con altri dispositivi che utilizzano contenitori più piccoli, anche se potenzialmente a sacrificio della finezza della polvere raggiunto. Inoltre, il costo dei dispositivi di fresatura meccanici può essere proibitivo per alcuni laboratori. Cryomilling può essere realizzato utilizzando un numero di configurazioni alternative 14-19, tra cui, più accessibile a mano con un parassitaLe e malta, anche se l'efficienza rottura scende notevolmente. protocolli di cattura Affinità tipicamente obiettivo per una elevata efficienza di lisi cellulare per facilitare l'estrazione massima proteina in soluzione e quindi massimo potenziale per la cattura dei complessi proteina bersaglio. D'altra parte, è stato dimostrato per il lievito in vitro splicing estratti che lisi massimo non può equiparare con massima in vitro attività biochimica 57,58. Non abbiamo osservato questi problemi nei sistemi che abbiamo testato finora, e quindi non volutamente limitare la nostra rottura delle cellule quando cryomilling. Tuttavia, tale possibilità deve essere tenuto presente quando l'ottimizzazione per saggi enzimatici in vitro. Sebbene cryomilling è un metodo molto efficace per rompere le cellule, un numero limitato di sonicazione spesso avvantaggia i omogenee di produzione estratti di cellule intere da tessuti di mammiferi perché aggregati omogenei possono talvolta essere osservate mediante ispezione visiva: tipicamentein condizioni di estrazione con bassa a moderata sale (100-300 mM) e un detergente non ionico (0,1-1% v / v) le concentrazioni. Poiché abbiamo osservato che la presenza di questi aggregati può ridurre il rendimento e / o la qualità della cattura affinità successiva, abbiamo quotidianamente realizziamo sonicazione per disperderli (anche quando non sono osservati ad occhio nudo). Gli aggregati sono coerenti con frammenti di membrana agglomerati, paragonabili a quelli precedentemente riportati in estratti di cellule di lievito fresate 58. Sonicazione è utilizzato anche in alcuni protocolli di taglio del DNA e liberare frammenti cromatina in soluzione, tuttavia il grado di sonicazione applicata in questo protocollo non è così apprezzabile frammento di DNA. La disponibilità limitata (o il costo elevato) di un ottimo legante affinità o di anticorpi contro la proteina di interesse particolare possono essere un altro ostacolo. Una vasta gamma di reagenti per affinità disponibili in commercio può essere sfruttata quando il modello organismo è suscettibile di codifica genomica o TRansfection con vettori di espressione ectopica, che permettono l'espressione di proteine ​​di interesse come fusioni affinità-tag. Tuttavia, la produzione di anticorpi personalizzati è diventato sempre fattibile e sia gli anticorpi policlonali e monoclonali possono prestazioni eccellenti in applicazioni di acquisizione di affinità. Queste molte considerazioni sono coperti anche in maggior dettaglio con riferimento 1.

Esempi di come il metodo di lisi cellulare e la scelta del mezzo di affinità possono influenzare risultati sono illustrati in Figura 1. Esempi di effetti esercitati da diversi estraenti può essere visto in riferimenti 1,11,24. Poiché questi ed altri parametri sperimentali influenzano la qualità della cattura affinità, il che rende difficile discriminare PQ, depositari di "proteomi perla" e approcci computazionali per eliminare i contaminanti non specifici sono stati sviluppati per aiutare a identificare PQ 40-43. Tuttavia, tali approcci solo substitute per la preparazione del campione ottimale in misura limitata 59. Osservando le migliori pratiche ed empiricamente ottimizzare l'esperimento di cattura affinità fornirà i campioni più di alta qualità per le analisi a valle, più discussi di seguito. Una pratica facilmente implementato in grado di migliorare la purezza del campione è eluizione nativo. eluizione nativo è più frequentemente usato per ottenere l'isolato complesso proteico affinità, intatto, per un ulteriore sperimentazione; ma migliora spesso la purezza del campione, può essere utilizzato anche solo per questo motivo. Tuttavia, come mostrato nella Figura 1, pannello II, la capacità di eluizione nativa per migliorare la purezza del campione può dipendere da una titolazione accurata della quantità di mezzo affinità per l'abbondanza della proteina bersaglio in estratto cellulare – quando il mezzo è in eccesso , paratopes non occupati possono consentire l'accumulo fuori bersaglio delle proteine ​​FP osservabili nelle frazioni eluite in modo nativo. Utilizzando i reagenti e le procedure descritte qui, hcome la nostra esperienza che il singolo più grande contributore di PQ ai nostri esperimenti è la proteina tag stesso, una volta rimosso dal contesto della cellula vivente. (Fig. 1, parte e Fig. S1). In tali casi, parentali controlli di linea di cellule che producono proteoma irrilevanti in assenza dell'antigene sono di alcun valore pratico; Allo stesso modo per tag-solo o spike nei controlli che sono privi di qualsiasi cosa, ma l'antigene bersaglio. Pertanto, ogni volta che pratico implementiamo I-DIRT 7,38, che misura direttamente l'accumulo di interazioni proteina post-lisi utilizzando MS quantitative. Come detto al punto 3.2.7 del protocollo, le procedure per l'eluizione nativo varieranno con i dettagli del sistema di affinità utilizzato. eluizione nativa è più comunemente ottenuta spostamento competitivo del complesso o proteolitico proteina marcata scissione del tag, rilasciando il complesso dal mezzo affinità. Diversi sistemi di affinità composto da piccoli tag epitopo esistono, for che l'epitopo stessa è disponibile come peptide utili per eluizione competitivo di complessi proteici tag 60. Allo stesso modo, diverse proteasi sono a disposizione per fendere specificamente siti affini strategicamente collocati in affinità taggati proteine di fusione 61. A seconda delle specifiche dei sistemi di affinità scelti, il regime di eluizione appropriata può essere adottata.

Generalmente, la qualità dei risultati ottenuti sarà significativamente influenzato dalla qualità della preparazione del campione. È importante lavorare con cura e precisione in ogni fase di questi protocolli, e il più rapidamente possibile, pur mantenendo cura e precisione. Si consiglia di monitorare la compartimentazione della proteina di interesse attraverso ogni passo per capire l'efficienza di ogni manipolazione. Ad esempio: come abbondante è la proteina di interesse nella cellula o tessuto in questione? Forse la proteina in fase di studio (e dei suoi complessi) sarà una sfida di caratterizzare in massaspettrometria a causa della bassa abbondanza. Se i complessi purificati sono rilevabili dalla colorazione della proteina generale (circa nanogrammi gamma), la spettrometria di massa è probabilità di successo. Se la proteina catturato di interesse può essere rilevata solo da sensibili migliorato western blotting chemiluminescenza (range di circa picogrammi), la spettrometria di massa è meno probabilità di essere efficace. Anche se la proteina di interesse è abbondante nella cellula, come abbondante è l'estratto di cellule prodotte? Fa la partizione di proteine ​​alla soluzione o è nel pellet? In quest'ultimo caso, una nuova soluzione di estrazione può essere concepito che possono migliorare il recupero. Una volta che l'estratto cellulare è combinato con il mezzo di affinità, come effettivamente viene catturata proteina? Ha la proteina rimane legato attraverso lavaggi successivi? Che dire di altre proteine ​​copurifying? Salvando un'aliquota di ciascun campione nelle appropriate fasi del protocollo queste domande possono essere facilmente risposta, tipicamente western blotting contro la proteina di interesseo colorazione delle proteine ​​generale, ma altri saggi possono essere idonei. Ottimizzare ogni passo sarà migliorare la resa e la purezza di complessi catturati, anche se ci può essere un trade-off da effettuare nel massimizzare un attributo o l'altro.

Una tipica applicazione di cattura affinità per molti ricercatori è identificare candidato interattori vivo per un piccolo numero di proteine di interesse; questi candidati sono comunemente sottoposti a convalida da approcci ortogonali in vivo per dimostrare il significato biologico interattori fisici. Cattura Affinity è impiegato anche da studi high-throughput per generare liste di copurifying proteine osservate su una base (quasi) proteoma-larga, facilitando inferenze computazionali relativi putativo in complessi in vivo. Numerosi esempi di tali studi possono essere trovati in letteratura. Questo approccio rinuncia ottimizzazione delle condizioni di cattura per ogni destinazione a favore dell'uomo esplorareobiettivi y; come tali, i complessi dedurre stessi sono raramente recuperati completamente intatto ed estremamente puro in ogni campione. Piuttosto, le sovrapposizioni parziali in composizioni osservate tra numerosi campioni per affinità catturato distinti sono usati come base delle inferenze 42. Entrambi gli approcci contribuiscono dati importanti per la nostra comprensione del interattoma. Tuttavia, uno dei principali vantaggi di cattura affinità è che spesso offrono la possibilità di ottenere i complessi intatto e altamente purificato, a condizione che gli sforzi sono fatti per ottimizzare la procedura. Noi crediamo che il futuro dell'approccio consiste nell'aumentare la facilità ed efficienza di ottimizzare la cattura di complessi proteici endogeni 11, per una valutazione più accurata della gamma di interattori fisiologici e l'uso più frequente nelle ulteriormente biochimica valle, enzymological, e gli studi strutturali, ad esempio, fa riferimento a 7,9,23.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il professor Brian T. Chait per i suoi preziosi consigli, supporto e accesso alla strumentazione MS, così come la signora Kelly R. Molloy per un eccellente supporto tecnico. Ringraziamo la signora Kelly nudo per il supporto con copy editing. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH sovvenzioni P41GM109824, P41GM103314, e P50GM107632.

Materials

Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm^2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62×44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) Retsch custom order For cryomilling (II)
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5 – 2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)
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LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).
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