לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.
Abstract
לכידת זיקה היא טכניקה יעילה לבידוד קומפלקסי חלבונים אנדוגניים למחקר נוסף. הפועל בשיתוף עם נוגדן, הטכניקה הזו גם הוא מכונה לעתים קרובות כמו immunoprecipitation. ניתן ליישם לכידת זיקה ב בקנה מידה הספסל בהקשר תפוקה גבוהה. כאשר מצמידים עם ספקטרומטריית מסה חלבון, לכידת זיקה הוכיחה להיות סוס עבודה של ניתוח interactome. אמנם יש דרכים רבות פוטנציאל לבצע את הצעדים הרבים המעורבים, הפרוטוקולים הבאים ליישם השיטות המועדפות שלנו. שתי תכונות הם ייחודיות: שימוש אבקת תא cryomilled לייצר תמציות תא, וחרוזי פאראמגנטיים מצמידים נוגדנים כמדיום הזיקה. במקרים רבים, השגנו תוצאות טובות לאלו שהושגו עם שיטות לכידות זיקה קונבנציונליות יותר. Cryomilling ימנע בעיות רבות הקשורות עם צורות אחרות של שבירת תא. הוא מספק שביר ביותר של החומר, תוך הימנעות denatבעיות uration הקשורים חימום או הקצפה. זה שומר על מעלה ריכוז חלבון הילידים עד כדי מיצוי, מקלי דיסוציאציה macromolecular. זה מקטין את זמן חילוץ חלבונים לבלות בתמיסה, הגבלת פעילות אנזימטית מזיקה, והוא עשוי להפחית את הספיחה הלא הספציפית של חלבונים על ידי מדיום הזיקה. מיקרון בקנה מידת מדיה מגנטית זיקה הפכה יותר רגילה לאורך השנים האחרונות, החלפה ויותר agarose- המסורתי מבוססת מדיה Sepharose. יתרונות עיקריים של מדיה מגנטית כוללים בדרך כלל חלבון ספיחה שאינה ספציפית נמוכה; אין גבול הדרת גודל בגלל מורכבות חלבון המחייב מתרחש על פני השטח החרוזים ולא בתוך הנקבוביות; וקלות מניפולציה וטיפול באמצעות מגנטים.
Introduction
יישום טיפוסי של שיטות העבודה שהוצגה בפניה הוא לייצב ולקבל תשואה וטוהרת גבוהות של קומפלקסי חלבונים אנדוגניים עניין לאפיון interactomic 1. מובן כי רשתות דינמיות של שני המתחמים ביציבות ויוצר באורח זמני הקשורים macromolecular, בעיקר המורכבים של חלבונים, לתזמר תהליכים תאיים 2,3. אמנם יש גישות ניסיוניות רבות לזיהוי אינטראקציות בין חלבונים, לכידת זיקה היא בין השיטות בשימוש הנרחבות ביותר עבור בידוד לנתח קומפלקסי חלבונים פיסיולוגיים 4-6. יתר על כן, טכניקה זו יש את היתרון של מניב מתחמי macromolecular כישויות פיזיות, לא רק כנקודות הנתונים מתוך לקריאה; לתועלתו, המתחמים שהושגו ניתן אפוא לשמש שורה של ביוכימיים במורד נוסף, אנזימטי, מבחנים מבניים 7-9. הפרוטוקולים שהוצגו פותחו כמענה לצורך למפות proteiרשתות אינטראקציה n-חלבון ולאפיין מתחמי macromolecular בתפקידים שלהם כמו מולקולות מפעיל של ביולוגיה של התא. הם מפורטים ביחס ויישומם בתאי יונקים הגדלים בתרבית רקמה, אך חלו גם על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות הנתונות tweaks ספציפי למערכת המתאימה.
ההיסטוריה של לכידת זיקה מותחת בחזרה בתחילת המאה עשרים עם הניסויים כרומטוגרפיה immunoaffinity הראשונים – דומה למה שמכונה בדרך כלל בימינו כמו immunoprecipitation (IP) – המופיע בספרות על ידי 1950 המוקדמים. השימוש המרכזי של הטכניקה פיתוח נוסף באמצעות תורו של המאה הזו ועד 10-13 הנוכחי. תאים שונים ומחקרים ביולוגיים מולקולריים יש ניצלה שבירים מכאנית של תאים על ידי כרסום בקירור במשך לפחות בארבעים השנים האחרונות 14-19; והפרדות מולקולריות ניצול (סופר) חרוזי פאראמגנטיים יש BECשת נפוץ יותר ויותר במהלך שני העשורים האחרונים 20. שילוב טכנולוגיות שונות אלה שמש כדי לשפר את תוצאות בסינרגיה שניתן להשיג בניסויים לכידים זיקת חלבון מורכבת 1, כפי שמעיד גוף נרחב של עבודות שתיכתבנה על ידי עצם וקהילת המחקר הרחבה יותר 7,9,11,18,19,21 -23. תוצאות תמיכה מוצגות באיור 1.
אוסף של אזהרות ושיקולים החלים על ביצוע ניסויים לכידת זיקה אפקטיבית ניתן למצוא התייחסות 1. בדרך כלל גישה זו היא המתאימה ביותר כדי: (I) לקטלג את interactors של חלבון של עניין, כלומר, להשתמש ספקטרומטריית חלבון מסה (MS) כדי לזהות חלבונים copurifying עד כה לא ידוע (ניתוח גישוש); (II) assay עבור נוכחות של שותף מתנגשות מסוים, כלומר, להשתמש ב- MS או כתם המערבי כדי לזהות חלבון מסוים או קבוצה מוגבלת של חלבונים חשוד בteract עם החלבון של עניין (בדיקת השערות); או (III) להכין קומפלקסי חלבונים מורכבים באופן אנדוגני המכילים את החלבון של עניין למחקר נוסף על ידי טכניקות נוספות (בדיקות preparative). לפני יציאת משטר ניסיוני לכידת זיקה הוא בהחלט הכרחי כדי להיות מגיב זיקה באיכות גבוהה כי נקשר לחלבון היעד, בדרך כלל נוגדן IP-מוסמכות נגד חלבון מטרת יליד הריבית או נגד תג המצורף חלבון היתוך. זה גם קריטי יש בשיטות של הודעה ניסיונית במקום: מכתים חלבון כללי (כגון כחול Coomassie, Sypro רובי, או כסף, SDS-PAGE הבא), מערבי סופגים, וחלבון של טרשת נפוצה כל נפוץ בשילוב עם לכידת זיקה 1. הפרוטוקולים שהוצגו לנצל חרוזים מגנטיים מצומדות נוגדן כמדיום זיקה. בעוד הפונקציה של מדיום הזיקה ניתן תוקף בתחילה בבדיקות לנצל כמה פרמטרים ניסיוניים, כדילהשיג את התוצאות הטובות ביותר כל ניסוי צריך להיות מותאם באופן אמפירי 1,11,24. הפרוטוקולים מופרדים לשלושה שלבים ייחודיים: (1) הכנת חומר תא קפוא; (2) תא שביר על ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורת קריוגני; ו (3) מיצוי חלבון ו לכידת זיקה באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצמידים נוגדנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלושה פרוטוקולים אלה לעבוד במקביל על מנת (1) להכין תאים עבור שבירה של מצב מוצק על ידי cryomilling, (2) להשיג שבירה בטחנת הכדור פלנטרית, ו (3) לייצר תמציות מתא אבקת זיקה לכידת חלבון של עניין מורכב עם interactors הפיזיולוגי אינו רב. רבות בטכניקות שונות תא תמוגה קיימות, כוללים גישות מכאניות / פיסיות העסקת ריסוק השפעה, גז, ו / או לחץ, כמו גם כימיות / גישות האנזימטית, כל אחד עם יתרונות וחסרונות שונים 49,50. חוקר מעודד כל לחקור שיטות המתאימות ביותר עבור הניתוחים שלהם, תוך התחשבות כי כל גישה שנבחרה שבירת תא מיצוי חלבון צפויה להציג הטיות 51,52 המחייב אופטימיזציה אמפירית (ראה להלן). שיטות מכאניות עלולות לייצר חום גבוה ו / או כוחות גז אשר יכול לשבש קומפלקסי חלבונים. Cryomilling ימנע תופעות חימום מכוח העסקת קירור 2 LN של דגימות עבור tמשך הוא של התהליך. טחנות כדור פלנטריים הם הבינו לסמוך על כוחות השפעת החיכוך, כוללים מאמץ גזירה, כמרכיבים של צמצום גודל חלקיקים 53,54. בהגדרות דיווח לא ראינו ניוון של קומפלקסי חלבונים. אכן יש לנו חילוץ והוציא כנראה פגע ~ 50 מתחמי נקבוביות הגרעין מד"א 11 ו enzymatically רטרוטרנספוזון פעיל מפגין פעילות ספציפית גבוהה יותר מאשר ההכנות העסקת 'עדין' מבוסס-דטרגנט תמוגה 7. שיטות כימיות / אנזימטית של תמוגה התא סובלות ההגבלה כי תוכן התא משתחרר לתוך המילייה במבחנה שתומכת שיבוש קרום תא מקרומולקולות מבני אבל לא יכול להיות מתאים תחזוקה של שלמות מורכב החלבון (es ) של עניין. לעתים קרובות, לא המרכיבים של מתחמי הקים עם החלבון של עניין ולא התנאים הדרושים כדי לייצב את מתחמי היעד הםידוע מראש. יתרון עיקרי של כרסום מצב המוצק הוא שבירה והפקה הם זוגיים, המתירים מקור חומר כדי להיות מוכנה ללא נוזל הוסיף, מאוחסן (ב -80 ° C או נמוך יותר), צברה, והוציאה נוח לניסויים על פי דרישה; למשל, לחקור אופטימיזציה בתנאים במבחנה עבור לכידת זיקה. אינטראקציות חלבון יציבות ביותר בריכוז גבוה 55,56, ולכן צמצום היקף extractant יכול להיות יתרון עבור שמירת אינטראקציות פיסיולוגיות. מצד השני, ישנם שיקולים מעשיים – מתחמי החלבון צריכים לעשות כדי להיות למחיצות מתוך התאים לתוך שלב מימי בלתי צמיג, ללא אגרגטים מסיסים, על מנת לערבב את מתחמי היעד עם מדיום הזיקה. יתר על כן, חלק סטנדרטיזציה וביקורת על הסביבה חוץ גופייה (pH, ריכוז מלח, וכו ') דרושות שיטתיות ועל שחזור. אנו מוצאים כי תמציות produced בטווח דילול של 1: 4-1: 9 (w: v) לספק דאגות מעשיות ותיאורטיות, מניב תוצאות איכותיות. בנוסף, שיעור אופטימלי של תמצית התא זיקה לצרכים בינוני שייקבע. הדבר נעשה באופן אמפירי על ידי טיטרציה של תמציות עם כמויות משתנות של מדיום זיקה יכול להיות השפעות לזיהוי על יחס אות לרעש של הניסוי, עוד נדון בהמשך. דלדול מעולה של חלבון המטרה הוא בדרך כלל ≥70% של השבר המסיס של חלבון המטרה, אבל> 90% רצויים ועלולים להיות ברי השגה עם parameterization הזהיר של תנאי חילוץ. שיקולים מעשיים רבים כגון מכוסי התייחסות 1. חרוזי פאראמגנטיים הם מניפולציה באמצעות מגנטי ניאודימיום בבעל צינור מיוחד microcentrifuge, למרות חלופות תוצרת בית הן קיימא. כאשר הניח בתוך מחזיק, חרוזים לאסוף בצד של הצינור תחת השפעת השדה המגנטי. הפתרונות עשויים מכן להסירו מבלי disturbing החרוזים.
מגבלה אחת של פרוטוקול cryomilling שהוצג, פותחת עם טחנת כדור פלנטרית משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים), הוא כי כמות מינימאלית של חומר נדרשה טחנה ביעילות לשחזר אבקת תא באמצעות המכשיר הזה (> g 1). כמויות כאלה מתקבלות בקלות עם חיידקים רבים, שורות תאים, ואורגניזמים מודל, וגם לעתים קרובות יכולות להיות מושגת עם רקמות הניכרות מן בחיות מעבדה. עם זאת, שורות תאים מסוימות עשויות להיות מאוד קשות לגדול ברקמות שפע בעלי חיים עשויים להיות נדיר. כמויות של חומר קטנים יותר ניתן הסתובבו וזהוב באמצעות מכשירים אחרים ניצול מכולות קטנות יותר, אם כי באופן פוטנציאלי על ההקרבה של עדינות אבקת מושגת. בנוסף, העלות של מכשירי טחינה מכאניים עשויה להיות יקרה מדי עבור מעבדות כמה. ניתן להשיג Cryomilling באמצעות מספר setups אלטרנטיבה 14-19, כולל, רוב משתלם ביד באמצעות הדברהle וטיח, אם כי יעילות שבירה טיפות באופן משמעותי. פרוטוקולים לכידי זיקה בדרך כלל לשאוף יעילות גבוהה של תמוגה תא כדי להקל מיצוי חלבון מקסימלית לתוך פתרון ומכאן, את מרב פוטנציאל עבור לכידתו של קומפלקסי חלבוני היעד. מצד השני, זה הודגם עבור שמרי שחבור במבחנת תמציות כי תמוגה מקסימלי לא יכולה להשוות עם מקסימאלית בפעילות הביוכימית במבחנת 57,58. אנחנו לא הבחנו בעיות כאלה במערכות בדקנו עד כה, ולכן לא בכוונה להגביל שבירת התא שלנו כאשר cryomilling. אף על פי כן, האפשרות הזאת צריכה לזכור בעת ביצוע אופטימיזציה עבור מבחנים במבחנה האנזימטית. למרות cryomilling היא שיטה יעילה מאוד עבור שבירת תאים, כמות מוגבלת של sonication לעתים קרובות הטבות תמציות תא הומוגנית הייצור כולו מרקמות יונקות כי אגרגטים הומוגניות לפעמים יכולים להיות שנצפו על ידי בדיקה ויזואלית: בדרך כללבתנאי חילוץ באמצעות נמוך עד בינוני מלח (100-300 מ"מ) ניקוי שאינו יוני (נ 0.1-1% / v) ריכוזים. מכיוון שאנחנו ציינו כי הנוכחות של אגרגטים אלה יכול להפחית את התשואה ו / או האיכות הלכידה הזיקה הבאה, אנו שגרתי ליישם sonication לפזר אותם (גם כאשר הם לא נצפו בעין בלתי המזוינת). המצרפים עולים בקנה אחד עם שברי קרום מגובבים, דומים לאלה שדווחו בעבר תמציות מתאי שמרים הסתובבו 58. Sonication משמש גם פרוטוקולים מסוימים גזירה DNA ולשחרר שברי הכרומטין לתוך פתרון, אולם מידת sonication להחיל בפרוטוקול זה לא DNA שבר ניכרת. הזמינות המוגבלת (או העלות הגבוהה) של ליגנד זיקה מעולה או נוגדן נגד חלבון מסוים של עניין עשוי להיות מכשול אחר. מגוון רחב של חומרים כימיים זיקה זמינות מסחרי ניתן למנף כאשר אורגניזם המודל ניתן תיוג גנומית או TRansfection עם וקטורי ביטוי אקטופי, המתירים את הביטוי של חלבונים בעלי עניין כמו התכה-tagged זיקה. עם זאת, בייצור הנוגדנים ונוהגין מגדיל את האפשרות ושניהם נוגדני polyclonal ו חד שבטיים יכולים לבצע מצוין ללכוד יישומי זיקה. שיקולים רבים אלה מכוסים גם ביתר פירוט ביחס 1.
דוגמאות איך שיטת תמוגה תא ובחירת בינוני זיקה יכולות להשפיע על תוצאות הן באיור 1. דוגמאות של השפעות שהפעילו extractants השונה ניתן לראות אזכור 1,11,24. בגלל הפרמטרים של הניסוי אלה ואחרים משפיעים על איכות לכידת זיקה, מה שמקשה להפלות FPS, מאגרים של "proteomes חרוז" ו גישות חישוביות לחסל מזהמים שאינם ספציפיים פותחו כדי לסייע בזיהוי FPS 40-43. אף על פי כן, גישות כאלה רק substitאוטה להכנת מדגם אופטימלי עד רמה מסוימת 59. התבוננות שיטות עבודה מומלצות לאופטימיזציה של הניסוי לכידת זיקה אמפירית תספק דגימות באיכות הגבוהה ביותר עבור ניתוחים במורד הזרם, עוד נדון בהמשך. תרגול מיושם בקלות שיכול לשפר טוהר מדגם הוא elution ילידים. elution Native נמצא דווקא בשימוש תכוף להשיג מורכב החלבון המבודד זיקה, ללא פגע, לניסויים נוספים; אבל כפי שהוא לעתים קרובות משפר טוהר המדגם, זה יכול לשמש גם מטעם זה בלבד. עם זאת, כפי שמודגם באיור 1, פאנל II, היכולת של elution יליד לשפר טוהר המדגם יכולה להיות תלויה על טיטרציה מדויק של כמות בינונית זיקה שפע של חלבון המטרה של תמצית התא – כאשר המדיום הוא העולה , paratopes הפנוי רשאי להתיר ההצטברות מחוץ היעד של חלבוני FP נצפים שברי eluted באופן מקורי. באמצעות ריאגנטים הליכים המתוארים כאן, זה hכמו מנסיוננו, התורם הגדול ביותר של FPS לניסויים שלנו הוא החלבון מתויג עצמו הסיר פעם מההקשר של התא החי. (איור. 1.II ו איור. S1). במקרים כאלה, שולטת שורת תאים ההורית שמניבות proteomes רלוונטי בהעדר האנטיגן להן כל ערך מעשי; גם לגבי תג בלבד או ספייק בבקרות שהן ריקות פרט האנטיגן היעד. לכן, בכל פעם המעשית אנו מקיימים I-DIRT 7,38, אשר ישירות מודד את ההצטברות של אינטראקציות חלבון שלאחר תמוגה באמצעות MS כמותית. כאמור בשלב 3.2.7 של הפרוטוקול, נהלי elution היליד ישתנו עם הפרטים של מערכת הזיקה בשימוש. elution Native מושג לרוב על ידי עקירה התחרותית של שסע החלבון מורכב או פרוטאוליטים המתויגים של התג, שחרור במתחם ממדיום הזיקה. מערכות זיקה כמה מורכבות תגי epitope קטנים קיימות, for שבו epitope עצמו זמין כמו פפטיד שימושי עבור elution התחרותי של קומפלקסי חלבונים מתויגים 60. כמו כן, כמה פרוטאזות זמינים לדבוק אתרים מאותו מקור ספציפי במיקום אסטרטגי זיקה מתויג חלבונים היתוך 61. תלוי את הפרטים של מערכות זיקה נבחרו, את ערכת elution המתאימה ניתן לאמץ.
באופן כללי, את איכות התוצאות שהתקבלו תושפע באופן משמעותי על ידי איכות הכנת המדגם. חשוב לעבוד בזהירות ובדייקנות בכל שלב ושלב של פרוטוקולים אלה, במהירות האפשרית, תוך שמירה על טיפול ודיוק. מומלץ לעקוב אחר חלוקת החלבון של עניין בכל שלב ושלב כדי להבין את היעילות של כל מניפולציה. לדוגמא: איך שופע הוא החלבון של עניין התא או רקמה מדובר? אולי החלבון נחקר (והמכלולים שלה) יהיה מאתגר לאפיין על ידי המוניספקטרומטריית בשל שפע נמוך. אם מתחמי המטוהרים ניתנים לזיהוי על ידי מכתים חלבון כללי (כ ננוגרם הטווח), ספקטרומטריית מסה עשויה להצליח. אם החלבון של עניין שנתפס ניתן לאבחון רק על ידי מערבי סופג chemiluminescent משופרת רגיש (טווח picogram כ), ספקטרומטריית מסה היא פחות סיכוי להיות יעיל. גם אם החלבון של עניין הוא שופע בתא, איך בשפע נמצא ב תמצית התא מיוצר? האם המחיצה חלבון לפתרון או שמא המטרה היא גלולה? אם האחרון, פתרון חילוץ חדש ניתן המציא שעשויה לשפר את ההתאוששות. לאחר תמצית התא משולבת עם מדיום הזיקה, איך ביעילות הוא החלבון בשבי? האם החלבון אבל מחובר לנצח באמצעות השטיפות הבאות? מה לגבי חלבונים copurifying אחרים? על ידי שמירת aliquot של כל דגימה על צעדים מתאימים לפרוטוקול השאלות הללו ניתן לענות בקלות, בדרך כלל על ידי מערבי סופג נגד החלבון של ענייןאו מכתים חלבון בכלל, אבל מבחני אחרים עשויים גם להיות מתאים. אופטימיזציה כל צעד תשפר את התשואה וטוהרת של מתחמים שנתפסו, אם כי ייתכנו trade-off להתבצע למקסם תכונה זו או אחרת.
יישום טיפוסי של לכידת זיקה חוקרת רבים הוא לזהות מועמד interactors vivo עבור מספר קטן של חלבונים בעלי עניין; אלה מועמדים חשופים בדרך כלל אימות על ידי גישות מאונכות in vivo כדי להדגים את המשמעות הביולוגית של interactors הפיסית. לכידת זיקה מועסקת גם על ידי מחקרי תפוקה גבוהה כדי ליצור רשימות של copurifying חלבונים שנצפו על בסיס (כמעט) proteome-רחב, דבר המקל על היקשים חישובית בנוגע משוער מתחמי vivo. דוגמאות רבות של מחקרים כאלה ניתן למצוא בספרות. גישה זו מוותרת אופטימיזציה של התנאי ללכוד עבור כל מטרה שניתן לטובת אדם לחקורמטרות y; ככזה, מתחמי מוסק עצמם בקושי מאוחזרות במלואו ללא פגם טהור מאוד בכל במדגם נתון. במקום זאת, החפיפה חלקית בקומפוזיציות נצפו בין דגימות זיקה שנתפסה ברורים רבים משמשת כבסיס של ההיקשים 42. שתי הגישות לתרום נתונים חשובים להבנתנו של interactome. אף על פי כן, אחד יתרונות גדולים של לכידת זיקה הוא שזה לעתים קרובות מציע את ההזדמנות להשיג את מתחמי שלמים נקיים במיוחד, ובלבד נעשים מאמצים כדי לייעל את ההליך. אנו מאמינים כי העתיד של הגישה טמון בהגדלת הקלות והיעילות של אופטימיזציה של לכידתו של קומפלקסים חלבונים אנדוגניים 11 עבור הערכה מדויקת יותר של מכלול interactors פיזיולוגיים שימוש תכוף יותר ביוכימי נוסף במורד הזרם, enzymological, ומחקרים מבניים, למשל, מפנה 7,9,23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פרופ 'בריאן טי חייט עבור ייעוץ, תמיכה שלא יסולא בפז שלו, וגישה למתקני בקרה-מדידה MS, כמו גם גב' קלי ר מולוי לקבלת תמיכה טכנית מעולה. אנו מודים לגב 'קלי Bare לתמיכה עם עריכת עותק. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענקים P41GM109824, P41GM103314, ו P50GM107632.
Materials
| Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
| 500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
| Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
| Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
| Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
| Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
| Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
| 50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
| 20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
| Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
| Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
| 50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
| Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
| Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
| Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
| Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
| Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
| mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
| 250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
| PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
| 5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
| 1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
| Extractant | For affinity capture (III) | ||
| cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
| Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
| Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
| Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
| low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
| Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
| Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
| Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
| Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
| Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
| SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
| DTT | For affinity capture (III) | ||
| SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
| SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
| Protein Stain | For affinity capture (III) |
References
- LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
- Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
- Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
- Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
- Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
- Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
- Liu, J. -. J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -. Y., Ke, A., Wang, H. -. W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
- Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
- Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
- Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
- Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
- Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
- Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
- Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
- Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
- Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
- Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
- Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. , 1-6 (2012).
- Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
- Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
- Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
- Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
- LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells. , (2011).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. . Basic Cell Culture Protocols. 946, (2013).
- Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
- Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
- Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
- Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
- Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
- Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
- Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
- Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
- Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
- Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
- Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
- Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
- Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1 (2005).
- Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839 (1999).
- Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
- Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
- Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
- Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
- Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
- Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
- Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
- Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201 (2012).
- Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm?. Cell. 30 (2), 345 (1982).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Kalkum, M. . Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, (2003).
- Staley, J. . Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , (2005).
- Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
- Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
- Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).
