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Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Published: December 09, 2016
doi:
10.3791/54518
, ,
1Laboratory of Cellular and Structural Biology,The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,New York University School of Medicine

Summary

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

Abstract

Affinitätseinfang ist eine wirksame Technik für die endogene Proteinkomplexe für die weitere Untersuchung zu isolieren. Wenn sie in Verbindung mit einem Antikörper verwendet wird, wird diese Technik auch als Immunpräzipitation häufig bezeichnet. Affinitätseinfangen in einer Labormaßstab und in einer Hochdurchsatz-Rahmen angewendet werden. Wenn sie mit Protein-Massenspektrometrie gekoppelt, Affinitätseinfangen hat sich als Zugpferd der Interaktom Analyse. Obwohl es möglicherweise viele Möglichkeiten gibt, beteiligt die zahlreichen Schritte auszuführen, implementieren die folgenden Protokolle unsere bevorzugte Methoden. Zwei Merkmale sind unverwechselbar: die Verwendung von cryomilled Zell Pulver Zellextrakten zu produzieren, und Antikörper-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen als Affinitätsmedium. In vielen Fällen haben wir überlegene Ergebnisse zu denen mit konventionelleren Affinitätseinfangen Verfahren erhalten wurde. Kryomahlen vermeidet zahlreiche mit anderen Formen von Zellbruch verbundenen Probleme. Es sorgt für eine effiziente Bruch des Materials bei gleichzeitiger Vermeidung denatration Probleme mit Heizung oder Schäumen verbunden. Es behält die native Proteinkonzentration bis zu dem Punkt der Extraktion, makromolekulare Dissoziation zu mildern. Es reduziert die Zeit extrahierten Proteine ​​in Lösung zu verbringen, schädliche enzymatischen Aktivitäten zu begrenzen, und es kann die nicht-spezifische Adsorption von Proteinen durch das Affinitätsmedium zu reduzieren. Micron-Skala magnetischen Affinitätsmedien haben mehr alltäglich in den letzten Jahren geworden, immer mehr die traditionellen Agarose- ersetzt und Sepharose-basierte Medien. Primäre Vorteile von magnetischen Medien umfassen typischerweise geringere nicht-spezifische Protein-Adsorption; keine Größenausschlussgrenze, da Protein-Komplex tritt eher auf der Oberfläche der Kügelchen Bindung als in den Poren; und eine einfache Manipulation und Handhabung mit Hilfe von Magneten.

Introduction

Eine typische Anwendung der vorgestellten Verfahren ist zu stabilisieren und eine hohe Ausbeute und Reinheit des endogenen Proteinkomplexe von Interesse für interactomic Charakterisierung 1 erhalten. Es versteht sich, dass die dynamische Netzwerke beider stabil und transient makromolekularen Komplexen verbunden sind , die hauptsächlich aus Proteinen besteht, zelluläre Prozesse 2,3 orchestriert. Zwar gibt es viele experimentelle Ansätze zur Identifizierung von Protein-Protein – Wechselwirkungen sind, ist Affinitätseinfangen unter den am häufigsten verwendeten Methoden zur Isolierung und physiologischen Proteinkomplexe 4-6 sezieren. Darüber hinaus hat diese Technik den Vorteil, die makromolekulare Komplexe als physikalische Einheiten ergibt, nicht nur als Datenpunkte in einem Auslese; Vorteilhafterweise können die erhaltenen Komplexe somit in einer Vielzahl von zusätzlichen nachgeschalteten biochemischer, enzymatischer und strukturelle Assays 7-9 verwendet werden. Die vorgestellten Protokolle wurden in Reaktion auf die Notwendigkeit entwickelt abzubilden protein-Protein-Interaktionsnetze und makromolekulare Komplexe in ihrer Rolle als die Effektormoleküle der Zellbiologie charakterisieren. Sie sind detailliert in Bezug auf ihre Anwendung auf Säugetierzellen in Gewebekultur gezüchtet, sind jedoch gleichermaßen anwendbar auf einen weiten Bereich von biologischen Proben bei entsprechender systemspezifische Optimierungen.

Die Geschichte der Affinitätseinfangen reicht zurück bis in den frühen zwanzigsten Jahrhunderts mit den ersten Immunaffinitätschromatographie Experimente – ähnlich, was man gemeinhin als Immunpräzipitation (IP) zu heute bezeichnet wird – von den frühen 1950er Jahren in der Literatur erscheinen. Mainstream Einsatz der Technik weiter durch die Jahrhundertwende der vorliegenden 10-13 entwickelt. Diverse Zell- und molekularbiologische Untersuchungen wurden durch Mahlen bei kryogenen Temperaturen zumindest in den letzten vierzig Jahren 14-19 mechanischen Bruch der Zellen verwendet werden ; und molekulare Trennungen unter Verwendung von (Super) paramagnetischen Perlen haben become immer häufiger in den letzten zwei Jahrzehnten 20. Die Kombination dieser unterschiedlichen Technologien hat dazu gedient , um synergistisch die Ergebnisse zu verbessern , die mit 1 in Proteinkomplex Affinitätseinfangen Experimente erhalten werden können, wie dies durch einen umfangreichen Werk von uns selbst und der breiteren Forschungsgemeinschaft produziert belegt 7,9,11,18,19,21 -23. Stütz Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.

Eine Sammlung von Einschränkungen und Überlegungen für effektive Affinitätseinfangen Experimente ausführen können in Bezug auf die 1 gefunden werden. Typischerweise ist dieser Ansatz am besten geeignet: (I) die Interaktionspartner eines Proteins von Interesse katalogisieren, dh Protein – Massenspektrometrie (MS) verwenden bisher unbekannte copurifying Proteine (explorative Analyse) zu identifizieren; (II) Assay auf das Vorhandensein eines bestimmten Wechselwirkungspartner, dh verwenden MS oder Western blot ein bestimmtes Protein oder begrenzten Satz von Proteinen in Verdacht nachzuweisenagieren mit dem Protein von Interesse (Hypothesentests); oder (III) vorbereiten endogen montiert Proteinkomplexe, die das Protein von Interesse für eine weitere Studie durch zusätzliche Techniken (präparative Aufarbeitung) enthält. Bevor Sie sich auf eine Affinitätsabfang-experimentelle Regime ist es absolut wichtig, eine qualitativ hochwertige Affinitätsreagens zu haben, die an das Zielprotein bindet, in der Regel eine IP-kompetenten Antikörper gegen das native interessierende Zielprotein oder gegen einen Tag zu einem Fusionsprotein angehängt. Es ist auch wichtig, geeignete Methoden der experimentellen Auslese an Ort und Stelle haben: allgemeine Proteinfärbung (wie Coomassie-Blau, Sypro Ruby oder Silber, nach SDS-PAGE), Western Blot und Protein-MS sind alle häufig in Verbindung mit Affinität Capture verwendet 1. Die vorgestellten Protokolle verwenden Antikörper konjugierten magnetischen Kügelchen als Affinitätsmedium. Während die Funktion des Affinitätsmedium kann zunächst in Tests validiert werden, die einige experimentelle Parameter nutzen, umerhalten die besten Ergebnisse sollte jedes Experiment empirisch 1,11,24 optimiert werden. Die Protokolle sind in drei unterscheidenden Phasen getrennt: (1) Herstellung von gefrorenen Zellmaterial; (2) Zellbruch durch Festkörper-Fräsen bei kryogenen Temperatur; und (3) Proteinextraktion und Affinitätseinfangen unter Verwendung von Antikörper-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen.

Protocol

1. Zellernte und Freezing Wachsen 1-8 g Zellmaterial die entsprechenden Kulturbedingungen für die Zelllinie von Interesse 25,26 verwenden. Dieses Protokoll wird für bis zu 8 Gramm Zellen (~ 10 9 Zellen) optimiert ist , von Referenzen 19,27,28 modifiziert. Typischerweise können ~ 5 g HEK-293 oder HeLa – Zellen aus acht 500 cm 2 Kulturplatten gezüchtet , um ~ 90% Konfluenz erhalten werden. ACHTUNG: Diese Protokolle verwenden flüssigem Stickstoff (LN 2), der fähig ist schwere Kälteverbrennungen verursachen. Don Schutzkleidung und Übung geeignete Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung. Gießen Sie das Wachstumsmedium (Abfall) in ein großes Becherglas aus. Legen Sie die Kulturschale auf Eis in einem großen rechteckigen Eis Pfanne. 20 ml eiskaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in die Kulturschale und lassen Sie die Zellen von der Schale eine große Zellschaber; Übertragung der Zellen auf eine 50-ml-Röhrchen auf Eis vorgekühlt; die Röhrchen auf Eis halten. HINWEIS: Für alle Zellen verwenden Handhabungsschritte ein elektro pipettor auf "niedrig" und 25 ml Pipetten übermäßige Scherung von Zellen während der Übertragung Manipulationen zu vermeiden. Ordnen Sie 50 ml Sammelröhrchen und 1x PBS in einem Eiskübel, bevor das Verfahren eingeleitet werden kann. Fügen Sie weitere 10 ml eiskaltem 1x PBS auf das gleiche Gericht. Sammeln Sie die restlichen Zellen und sie auf die 50-ml-Tube. Wiederholen Sie für jedes Gericht; Zellsuspensionen aus verschiedenen Gerichten können Probennummer und Kunststoffabfälle zu reduzieren kombiniert werden. Hinweis: Da die Zellen selbst nicht einen großen Anteil des Suspensionsvolumens bilden, drei Platten Wert der Zellsuspension in zwei 50-ml-Röhrchen kombiniert werden können. Da 50-ml-Röhrchen tatsächlich mehr als das Nennvolumen halten, acht Platten können in der Regel über fünf solcher Rohre verteilt werden. Zentrifuge für 5 Minuten bei 1.000 · g, 4 ° C. abgießen vorsichtig den Überstand. Resuspendieren jedes Pellet in 10 ml eiskaltem 1x PBS. Konsolidieren der resuspended Pellets, bis zu 5 pro 50 ml-Röhrchen, Probennummer zu reduzieren. Zentrifuge 5 min bei 1.000 · g, 4 ° C. abgießen vorsichtig den Überstand. Das Pellet in 10 ml eiskaltem 1x PBS Entfernen Sie den Kolben aus einer 20-ml-Spritze und zur Seite legen. Kappe die Düse der Spritze und übertragen die Zellsuspension zu. Legen Sie die Spritze in einem 50-ml-Röhrchen und Zentrifuge 5 min bei 1000 × g, 4 ° C. Den Überstand aspirieren mit einer feinen Spitze Pipette auf eine Vakuumfalle System angeschlossen, bis nur die oberste Schicht der Zellen beginnt gesaugt zu werden. Dies führt zu einer nassen Zellpellets. Uncap die Spritze, um den Kolben einsetzen und die Zellen tropft direkt in einen großen Becher aus Kunststoff mit LN 2 gefüllt, gehalten in einem LN 2 Bad in einem Styropor – Box. Gewaltsam tauchen die restlichen Zellen aus der Spritze. Übertragen Sie die gefrorenen Zellen auf 50-ml-Röhrchen durch Gießen. Lose Kappe der Rohre 2 Überschuss LN verdampfen zu lassen; halten tSaum über Nacht bei -80 ° C. Ziehen Kappen voll am nächsten Tag. Die gefrorene Zelle kann bis Cryomahlung bei -80 ° C auf diese Weise gespeichert werden. HINWEIS: Schließen Sie nicht fest die Röhren vor allem die LN 2 sichtbar verdampft ist, ansonsten übermäßigen Druck kann das Rohr zur Explosion bringen. Schließt nicht die Rohre nach dem LN 2 in der Ansammlung von Frost führen kann auf die Zellen Material abgeführt wurde, um überschüssiges Wasser Gewicht hinzufügen und effektiv die Proteinkonzentration auf Mahlen reduziert wird . 2. Cryogenic Störung der gefrorenen Zellen HINWEIS: Alle Werkzeuge für das Fräsen und Manipulationen sollten 2 mit LN vorgekühlt werden. Eine kleine Dekanter wird für das Hinzufügen von LN 2 im Glas und zum Ausgießen LN 2 über die Oberseite des geschlossenen Fräsen Glas erforderlich. Ein hausgemachtes Werkzeug wird in Bezug 19 gezeigt. Kryo – Handschuhe sind erforderlich , um die LN 2 gekühlt Mahlapparate zu handhaben . Das Fräsenjar Deckel typischerweise hier (siehe Tabelle der Materialien) eingesetzt werden , installiert mit einer Gummidichtung versenden; Diese müssen mit einem handelsüblichen Teflon Deckeldichtung ersetzt werden, um zuverlässig das folgende Protokoll auszuführen. Des Weiteren , weil der Druck von gasförmigem N 2 kann bis zu einem hohen Niveau im Gefäß während des Mahlens bauen, empfehlen wir die Installation eines im Handel erhältlichen 5 bar / 500 kPa Druckventil als Sicherheitsfreigabe vorsorglich 28. Entfernen Sie Zelle Perlen von -80 ° C Lagerung und halten in einem 50 ml – Rohrhalter in einem LN 2 Bad. Pre-kühlen die 50 ml – Glas, zwei 20 – mm – Kugeln und Deckel in einem sauberen rechteckigen Eis Eimer mit LN 2. Vorzukühlen das Polytetrafluorethylen (PTFE) Isolator, wenn eine verwendet wird; entweder ein Satz von Pucks (siehe 27 Referenz) oder eine Hülse-und-Puck (siehe Abbildung 2). Vorkühlung ist abgeschlossen , wenn die gewaltsame Sieden von LN 2 beruhigt. Setzen Sie geeignete Gegengewicht auf derMühle. Hinweis: das wird auf die Masse des Glases gleich sein, Behälterdeckel, wobei die Mahlkugeln verwendet, und die Menge der Zellen in das Gefäß gegeben werden. Wenn irgendwelche PTFE-Isolatoren verwendet werden, sollten ihre Masse ebenfalls einbezogen werden. Wir schlagen vor, die Aufzeichnung der Massen des Glases, Deckel und Kugeln (und ihre kombinierte Masse, einschließlich der Isolator verwendet wird) im voraus und Aufzeichnen sie auf einem Informationsblatt in der Nähe der Mühle gelagert. Mit einer Pinzette, legen die beiden vorgekühlte 20 mm Mahlkugeln und die gefrorenen Zellen innerhalb des vorgekühlten Fräsen Glas. Hinweis: Aufgrund der geringen Materialverluste an den Glas und Kugeloberflächen während des Mahlens, der Anteil der verwerteten Stoffe zunimmt, wenn die Masse von Zellen gemahlen zunimmt. Durch das beschriebene Verfahren sind Materialverluste sehr bescheiden, in der Größenordnung von ~ 0,3 g Naßzellgewicht (WCW) zu sein. Die Richtlinien des Herstellers zeigen das maximale Volumen der Probe sollte ~ 1/3 Glas Volumen sein geladen. 29 Das Gesamtvolumen der Kugeln sollte ~ 1/3 und remaining ~ 03.01 Freiraum für eine freie Bewegung der Kugeln. In LN 2 in das Gefäß bis ~ ½ voll, den Deckel auf den Topf und übertragen Sie die Montage in die Mühle. HINWEIS: Zuerst die gewählte Isolator installieren, wenn man mit. Klemmen Sie die Montage an Ort und Stelle und führen drei Zyklen Fräsen mit folgendem Programm: 400 rpm, 3 min, Rückwärtsdrehung jede Minute, keine Pause Pause. Kühlen Sie die Fräs – Glas mit LN 2 zwischen jedem Zyklus. HINWEIS: Während eine deutliche clunking Lärm Fräsen erzeugt wird, wie die Kugeln im Glas in Planetenbewegung kollidieren. Wenn diese Töne nicht zu hören sind, Fräsen nicht auftritt. Beenden Sie die Fräszyklus, nicht diesen Zyklus zählen, das Glas Montage zurück zu LN 2 bewegen und prüfen Sie den Inhalt des Glases. Stellen Sie sicher, kein Eis gebildet hat, und wenn es hat, Chip aus den Glas Wände weg mit einem vorgekühlten Spachtel. Beginnen Sie noch einmal ab Schritt 2.5. Wenn keine Isolator oder Isolator Pucks verwenden, bewegen Sie das Glas Montage zurück zu LN <sub> 2 zwischen den Zyklen neu zu kühlen und LN 2 bis ~ ½ voll jedes Mal hinzufügen. Die LN 2 hinzugefügt im Glas , wenn die Temperatur des Glases erhöht sich während des Mahlens verdampfen. Dies führt zu Druckaufbau im Glas. Deshalb wird, wenn das Glas aus der Mühle ausgerückt, lassen Sie die Klemme sehr langsam. Wenn die Klemme schnell freigesetzt wird, kann Zelle Pulver mit einer schnellen Entspannung zu entkommen. Eine langsame Freigabe der Klemme ermöglicht den Druck aus dem Glas in einem sanften, kontrollierten Art und Weise zu entkommen, und verhindert den Verlust von Zellmaterial. Die sanfte Entweichen von gasförmigem N 2 kann oft Zischen zu hören , wie die Klammer langsam freigesetzt wird – das ist normal. Bei Verwendung eines hülsen und Puck – Isolator kann das Glas Montage in der Mühle links und LN 2 hinzugefügt , um die Isolator / jar Montage in situ. Bewegen Sie das Glas wieder auf LN 2, und lassen Sie einen Moment abkühlen ruhen. Bei Verwendung eines hülsen und Puck-Isolator kann das Glas aus der Hülse entfernt werden with Hilfe von zwei Spateln, Mobilisierung von auf beiden Seiten. Sobald das Glas in LN ruht 2, entfernen Sie vorsichtig den Deckel, entfernen die Kugeln einer Pinzette, und übertragen das Pulver auf eine vorgekühlte 50 ml – Röhrchen eine vorgekühlte Spachtel. Hinzufügen eines kleinen LN 2 auf das offene jar / Pulver kann helfen Pulver zu entfernen, die auf die Kugeln verkrustet ist, bevor sie zu entfernen. HINWEIS: Sobald die Dose geöffnet wurde, fügen Sie eine kleine Menge von LN 2 , um es vor den Kugeln zu entfernen. Dies wird helfen, Pulver auf den Oberflächen verkrustet zu erholen. Zellpulver sollte bis zur Verwendung bei -80 ° C oder darunter gehalten werden. Nach unserer Erfahrung können Zell Pulver auf diese Weise gespeichert werden, im Wesentlichen auf unbestimmte Zeit, ohne die Leistung zu beeinträchtigen. 3. Affinity Erfassung von Proteinkomplexe aus Zellextrakten ANMERKUNG: Das folgende Protokoll implementiert Affinitätsmedien, bestehend aus einem Affinitätsliganden, Köder, oder Antikörper, die mit dem Protein von Interesse, co interagiertupled paramagnetischen Perlen im Mikrometermaßstab. Diese können in-house 19,30 hergestellt werden, die im Handel erhältlichen Kits, oder gekauft als fertige Reagenzien. Zellextraktzubereitung HINWEIS: Bei der Zelle Pulver Handhabung erinnern Utensilien und Rohre zu verwenden , vorgekühlt mit LN 2. Rohre , die die Zelle Pulver enthält , sollte immer auf LN 2 gehalten werden , wenn nicht bei -80 ° C. Legen Sie die 50 – ml – Tube (n) enthaltenden Zell Pulver in einem Rohrgestell, in einem Styropor – Behälter mit LN 2. Man wiegt 100 mg Zell Pulver in ein 1,5 oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Anmerkung: Wir haben festgestellt, dass diese Menge an Zellen ist ein guter Ausgangspunkt, die normalerweise für das Zielprotein zu Hunderten von Nanogramm in zweistelliger Ausbeute wird reichen nach Affinitätseinfangen für eine mäßig exprimierten Proteins (~ 50 kDa Masse, die an Tausenden von Exemplaren pro Zelle), sind die Extraktion und Einfangeffizienzen des Ziel vorausgesetzt ≳70%. Solche Ausbeuten für die direkte visualization des gereinigten Fraktion durch SDS-PAGE und Proteinfärbung. Tare Analysenwaage mit dem leeren Mikrozentrifugenröhrchen. Dispense Zelle Pulver in ein Rohr ein LN 2 gekühlt Löffel oder Spachtel. Schauen Sie sich die Masse des in der Röhre verzichtet Pulver auf der Analysenwaage. HINWEIS: das Wiegen von Zell Pulver, kleinen Volumenmesslöffel verwendet werden kann zu erleichtern. Diese wurden gefunden reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten (siehe 19 Referenz). Wir haben die besten Ergebnisse mit Schraubverschluss oder "Safe-Lock 'Reaktionsgefäße gefunden. Druck verdampft LN 2, die die Rohre eindringen können Standard – Mikrozentrifugenröhrchen kurz vor der Zugabe der Extraktionslösung während der anschließenden Erwärmung öffnen Pop verursachen kann – möglicherweise zum Verlust der Probe. Öffnen Sie das Rohr (oder lösen Schraubverschluss) mit Zellpulver und lassen Sie sich für 1 min bei RT stehen. Dies wird freigeben Druck innerhalb der Röhre und verhindern, dass die sofortige Einfrieren der ExtraktionLösung, wenn dem Pulver zugesetzt. Kein Auftauen wird während dieser 1 min Inkubation beobachtet. In 400 ul Extraktionsmittel ergänzt mit Proteaseinhibitoren und Wirbel kurz, dann auf Eis zu halten, während Sie fortfahren 3.1.5 zu treten. Die Proben sollten auf Eis zwischen allen nachfolgenden Manipulationen bis Elution gehalten werden. HINWEIS: Die beste Zusammensetzung des Extraktionsmittels hängt von dem Protein-Komplex (es) gereinigt werden. Einige allgemeine Hinweise sind in Tabelle 1 und die Stütz Referenzen zur Verfügung gestellt. Verwenden Sie ein microtip Ultraschallgerät die Probe eine kurze niedrigen Energieimpuls zu geben, alle Aggregate zu dispergieren. (Ultra) beschallen mit 4 Impulsen (2 sec je, 2 A, ca. 15-20 J der Gesamtenergie). HINWEIS: Vortexen verzichtet die Zelle Pulver in das Extraktionsmittel, aber je nach der Lösung Charakter können einige Aggregate beobachtet. Wir haben herausgefunden, dass diese Aggregate Dispergieren bei der anschließenden Affinitätseinfangen für die beste Ausbeute liefert. Eine kurze microtip soniKation streut leicht diese Aggregate. Die Lösung sollte erscheinen halbtransparentes, aber homogen, ohne offensichtliche Aggregate. Wasserbad Beschaller neigen dazu, zu geringer Leistung effizient solche Aggregate zu dispergieren, ohne wesentlich längere Probenbearbeitungszeiten, kann aber mit entsprechenden Einstellungen geeignet sein. Klärung des Extrakts durch Zentrifugation (beispielsweise 20.000 xg, 10 min, 4 ° C). HINWEIS: Ein Aliquot des geklärten Zellextrakt kann zum Vergleich mit dem Inhalt des Pellets, der post-Affinitätseinfangen Überstand gespeichert werden, und die erhaltenen Fraktionen nach der Elution von dem Affinitätsmedium, die Effizienz der Extraktion und Einfangen des Zielproteins zu bestimmen, , zum Beispiel durch Western – Blot (siehe Diskussion). Entfernen Sie den Überstand (geklärte Extrakt) und fahren Sie mit der Affinität Erfassung. HINWEIS: Das Pellet bei 70 ° C in SDS-PAGE-Probenladepuffer werden reextrahiert kann den Grad der Freisetzung des Zielproteins zu bestimmen, dährend die anfängliche nichtdenaturierendes Extraktion durch Vergleich mit dem in Schritt 3.1.6 erhaltene Extrakt. Affinitätseinfang Vorwäsche des magnetischen Affinitätsmedium. Dies kann durchgeführt werden, während Zellextrakte zentrifugiert werden. Das Röhrchen (n) auf dem Magneten. Die Kügelchen werden innerhalb von Sekunden auf der Seite des Rohrs ansammeln, die Speicherlösung ermöglicht entfernt werden. In 500 ul Extraktionslösung zu Perlen. Kurz Wirbel Mischung bei mittlerer Geschwindigkeit (ausreichend zu suspendieren). Pulse-Spin die Rohre in einer Mini-Zentrifuge alle Inhalte auf den Boden zu sammeln. Dadurch wird sichergestellt, die minimale Verschleppung von Lösungen. Die Röhrchen auf dem Magneten und die Lösung anzusaugen. HINWEIS: Magnetische Medien mit besonderen Eigenschaften aus einer Vielzahl von kommerziellen Anbietern zur Verfügung stehen. Die Ergebnisse können je nach diesen Merkmalen abhängig, einschließlich Kugelgröße, Einheitlichkeit, Oberflächenbeschichtung und Antikörper-Kopplungschemie. Side-by-side Versuche in Ihrer Anwendung, bevor sie sich auf einer Wahl Reagens empfohlen. Starten Sie die Affinität Erfassung durch die geklärte Zellextrakt zu einem 1,5-2,0 ml-Röhrchen übertragen, enthaltend vorgewaschene Affinitätsmedium und Wirbel kurz wieder zu suspendieren. Inkubieren für 30 min bei 4 ° C unter kontinuierlichem leichtem Mischen auf einem Rotator Rad; die Kügelchen sollten während der Inkubation suspendiert bleiben. Puls-spin die Rohre in einer Minizentrifuge alle Inhalte auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln. Saugen Sie den Überstand und Waschen der Kügelchen dreimal mit 1 ml kaltem Extraktionslösung als 3.2.3 in Schritt beschrieben. Die Röhrchen auf den Magneten. Entfernen Sie die Lösung. Gehen Sie mit der nächsten Lösung hinzuzufügen und zu wiederholen. Während des 2. waschen, übertragen Sie die Perlen und Waschlösung zusammen in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen durch Pipettieren. Dies reduziert Probenkontamination, am Punkt der Elution durch gelegentliches Proteine ​​an die Wände des Rohres mit t für die Inkubation verwendet adsorbierter Zellextrakt. Nach der 3. Wäsche sollten die Perlen Pulsgesponnenen kurz in einer Mini-Zentrifuge sein , alle Inhalte auf dem Boden zu sammeln. Das Röhrchen wieder auf dem Magneten, und entfernen Sie alle Restflüssigkeit. Dies ermöglicht die Entfernung des letzten ul Lösung vor Elution der eluierten Proben gewährleistet werden einheitliche Volumina aufweisen. Es stellt auch sicher die Elution wirksam sein wird, da die Elutionslösung nicht durch Restwasch verdünnt werden; solche Reste können auch Salzeffekte beitragen und die Migration von Proteinen in SDS-PAGE (siehe unten) ändern. HINWEIS: Ein Aliquot des post-Bindungsüberstand kann in 3.1.6 erzeugt zum Vergleich mit der geklärte Extrakt gespeichert werden. durch Western-Blot. Das Ergebnis wird den Grad der Verarmung des Zielproteins aus dem Zellextrakt anzuzeigen. Eluieren entweder in einer nativen oder denaturierenden Weise; betrachten die Strategie am besten für die Downstream – Anwendung 1. HINWEIS: Die Einzelheiten der nativen Elution strategies hängt von der Affinität Tag verwendet (siehe Diskussion). Für die meisten Benutzer denaturierenden Elution mit SDS-PAGE Probenpuffer durch die Analyse der Probe durch SDS-PAGE mit Proteinfärbung 31 gefolgt wird die praktischste anfänglichen Ansatz. HINWEIS: Die Zusammensetzung des Probenpuffers wird auf dem Elektrophorese-System abhängen verwendet werden. Viele Labore werfen ihre eigenen Tris-Glycin – Gele, die Verwendung von diskontinuierlichen Elektrophorese Herstellung und dem Laemmli – Puffersystem 32-34. Ein gemeinsamer Probenpuffer Rezept (1x) umfasst: 10% (w / v) Sucrose, 50 mM DTT, 2% (w / v) SDS, 62,5 mM Tris-Cl pH 8,8, 0,0004% (w / v) Bromphenolblau 31 . Wir schlagen vor, die Vorbereitung eines 1,1x Aktie, die DTT lässt. 1/10 des Volumens von 500 mM DTT zu der Probe vor der SDS-PAGE gegeben werden sollte (siehe unten). Viele im Handel erhältliche SDS-PAGE-Systeme sind ebenfalls verfügbar; diese können systemspezifische Probenpuffer enthalten. In SDS-PAGE-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel (zur Minderung der Freisetzungvon Antikörperketten von den Kügelchen) und für 5-10 min bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Hinweis: das wird stören die meisten Affinität-basierten Interaktionen, die aufgenommenen Proteine ​​in den Überstand freigesetzt wird. Weitere persistent Wechselwirkungen von erhöhter Temperatur für die Freigabe profitieren kann (in der Regel 70 ° C ist ausreichend). Sammeln und den Überstand zu speichern. Proben können für kurze Lagerung (wenige Tage) oder -80 ° C zur Langzeitlagerung bis zur Analyse gewünscht wird bei -20 ° C eingefroren werden. Unterwerfen die Proben SDS-PAGE , gefolgt von Proteinfärbung unter Verwendung von Standardtechniken 31. MS kann die Probenzusammensetzung 1 zu charakterisieren verwendet werden. Einzelne Proteinbanden zur Identifikation oder die gesamte Probe werden exzidiert kann nur kurz (4-6 mm in das Gel) durch Elektrophorese der Probe in einer einzigen Analyse charakterisiert werden, und Verarbeiten aller Proteine ​​in der Probe zusammen als "Gel-Stecker. ' HINWEIS: In DTT vor initiating-Elektrophorese. Wenn die Planung zu MS fortfahren können Proben nach der Elektrophorese 35 alkyliert werden; es ist jedoch häufig bequemer zu alkylieren vor der Elektrophorese 36.

Representative Results

Abbildung 1, Tafel I zeigt , dass Kryomahlen und magnetische Kügelchen können zusammen Probenqualität weiter zu verbessern. Paneele IA-C zeigen , daß das Material des unlöslichen Medium für den Affinitätseinfang verwendet , umfassend 19 des wiedergewonnenen Proteom beeinflussen können. Das Protein von Interesse, gereinigter FLAG-markiertes bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP), wurde in menschlichen Zellextrakten versetzt. BAP wird erwartet, dass nicht speziell zur Interaktion und menschliche Proteine ​​copurify. Die Signatur copurifying Proteine, beurteilt durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung, variiert je nach dem verwendeten Medium. Micron Maßstab magnetischen Kügelchen zeigte die sauberste Profil, mit einem relativ niedrigen Niveau der unspezifischen Proteinadsorption hindeutet. Platten-ID und IE zeigen, daß das Verfahren der Zelllyse auch die zurückgewonnene Proteom beeinflussen können. In dem gegebenen Beispiel ist ein endogenes Protein – Komplex (der NEXT – Komplex 37), wurde Affinität captu ausgesetztre von cyromilled oder beschallte Zellextrakten 19. Weniger hohe Massen Verunreinigungen wurden beobachtet, wenn der Zellextrakt aus cryomilled Zellpulver hergestellt wurde. Eine Herausforderung bei der Affinität Capture mit endogenen Proteinkomplexen zu untersuchen ist, dass es schwierig sein kann, bona fide physiologischen Interaktoren des Proteins von Interesse von False Positives (RP) zu unterscheiden. FPs können aus vielen Quellen entstehen, einschließlich der nicht-spezifischen Adsorption an Rohren und Behältern, die Affinitätsmedium, dem Antikörper oder Affinitätsliganden, und / oder an das Protein von Interesse selbst. Als Ergebnis müssen erhebliche Anstrengungen zur Optimierung der Erfassungsprozess gewidmet. Der Nachweis von FPs bleibt eine zentrale Herausforderung für die eine große Anzahl von unterschiedlichen Werkzeugen entwickelt wurden, einschließlich experimenteller 38-40 und rechnerische Ansätze 41-43, die jeweils mit unterschiedlichen Vor- und Nachteile. In eigenen Versuchen stellten wir fest, die zuvor ein Muster von FP Proteinbindung, erhalten nach Inkubation von α-FLAG magnetisches Medium mit Kontroll-Zellextrakten, war, daß die sich von dem Muster in Gegenwart erhaltenen 3xFLAG-markierte Proteine. Darüber hinaus könnten diese FPs aus dem Medium durch die Inkubation mit Peptid 3xFLAG 7 freigegeben. Diese Beobachtung ist konsistent mit opportunistischen Bindung von FPs an die α-FLAG Paratop in Abwesenheit des verwandtes Epitop. die Natur dieser FP Hintergrund zu verstehen, ist wichtig, da viele Studien unmarkiert "Elternzelllinie" als Scheinkontrolle für Affinitätseinfangen verwenden; Diese Kontrollen können daher nicht angemessen sein, um die Spezifität der Wechselwirkung mit dem markierten Protein zu bestimmen. Um den Hintergrund zu bestimmen, die Bindung von unseren Affinitätsmedium beigetragen, wenn Antikörper Paratope besetzt sind oder nicht, durchgeführt wir mock Affinitätseinfangen Experimenten unter Verwendung von α-FLAG magnetischen Medium und HEK 293T-Zellextrakte (kein tagged Protein exprimiert) in Gegenwart oder Abwesenheit eines 3xFLAGPeptid-Spike-in. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1, Tafel II gezeigt. Kurz gesagt, wurde für 30 min in Zellextrakten (von ≳10 mg / ml Gesamtprotein), enthaltend 500 mM NaCl und 1% v / v Triton X-100 in 20 mM HEPES-Na, pH 7,4, inkubiert magnetischen Medium α-FLAG. Das Medium wurde dann mit 1 mg / ml 3xFLAG Peptid inkubiert, um kompetitiv alle Proteine ​​an die α-FLAG Paratop nativ oder mit SDS-PAGE-Probenpuffer gebunden verdrängen eine denaturierende Elution zu erreichen. Zusätzlich wurde das gleiche Experiment durchgeführt, wenn die Zellextrakte mit 1 ug / ml und 10 ug / ml Peptid 3xFLAG versetzt wurden. Alle eluierten Fraktionen wurden auf SDS-PAGE und Silberfärbung unterzogen. Wir beobachteten , dass in Abwesenheit von seinem verwandten Epitops, α-FLAG Medium eine detektierbare Pegel des Hintergrundproteine nicht erfassen , die mit 3xFLAG Peptid eluiert werden kann – in der durch Fig versehen Beispiel 1-II, eine dominante Spezies wurde bei zwischen 37 beobachtet und 50 kDa. Das Muster eluiert mitSDS-PAGE-Probenpuffer war vergleichbar mit zusätzlichen prominent Arten. Jedoch in Gegenwart von 1 & mgr; g / ml Peptid 3xFLAG, FP an die Affinitätsbindungsmedium wurde unterhalb der Nachweisgrenze eliminiert und wurde in entweder den nativen oder denaturierenden Elutionsfraktionen nicht beobachtet. Dieses Ergebnis legt nahe, dass unbesetztes Antikörper Paratope während Affinitätseinfangen auch auf Antikörper, erhalten in Abwesenheit ihres zugehörigen Epitop und tragen wesentlich zur Proteom promiskuitiv, die ihre Epitop mit hoher Affinität binden, wie es der Fall für die 3xFLAG ist / α-FLAG M2 Paarung. Es suggestd auch, dass sehr stringenten Bedingungen mit hohem Salz verwenden, häufig gewählten unspezifische Bindung zu verringern, kann in Abwesenheit des Antigen / Antikörper-Wechselwirkung unwirksam. Follow-up wir ein ähnliches Experiment einschließlich der Analyse durch SDS-PAGE sowie quantitative MS (Abb. S1) durchgeführt. Von den 347 Proteinen quantifiziert, beobachteten wir, dass jedes Protein für eine (falsche Disco sparensehr Rate = 1%; Tabelle S1) wurde mit dem 3xFLAG-markierten Köderprotein assoziiert im Vergleich zu einer 3xFLAG Peptid Kontrollprobe versetzt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in unseren Experimenten die überwältigende Mehrheit der Proteine ​​beobachtet, wahrscheinlich zusammen reinigen mit dem markierten Protein oder sind off-target Nebenprodukte der unbesetztes α-FLAG Paratope. Unserer Erfahrung nach hohen Signal-zu-Rausch-Affinitätsabfang-Ergebnisse sind in der SDS-PAGE und Proteinfärbung durch eine diskrete Muster von scharfen, reichlich und in etwa stöchiometrischen Bands sowie eine geringe Menge von Hintergrundfärbung von anderen blasser Bands exemplifiziert; zahlreiche Beispiel dieses Prinzips kann in Referenz 11 gesehen werden. Das Motiv für einen PTFE – Isolator mit (was empfohlen wird) , wenn Cryomahlung ist die Rate der Erwärmung des Glases während des Mahlens zu reduzieren, während des Mahlvorgangs die Last der wiederholten LN 2 Kühlung minimieren und reduzieren den Grad der EisBildung in den Topf. Dies erleichtert konsistente Mahlleistung und erleichtert die Handhabung des Zell Pulver. Beispiel Isolatoren können in Referenz 27 (Pucks) und dargestellt in Figur 2 unten (hülsen and-Puck) gefunden werden. Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse auswählen. (I) Dieses Panel wurde von Referenz 19 modifiziert. Coomassie Blau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel. (LINKS) Micron-Skala magnetische Kügelchen zeigen unteren Off-Target-Bindung als Agarose-basierte Medien. (A) magnetische Kügelchen; (B) traditionelle Agarose; (C) Eisen imprägniert (magnetisch) Agarose; jeweils mit anti-FLAG M2-Antikörper und verwendet FLAG-getaggten bakterieller alkalischer Phosphatase zu erfassen (BAP; gekennzeichnet) versetzt in Extrakten hergestellt aus cryomilled HEK-293-Zellen. Agarose-basierte purificationszeigten höhere unspezifische Adsorption (unmarkiertes Bänder). (RIGHT) Auszüge aus cryomilled HeLa-Zellen hergestellt werden, zeigen geringere Off-Target-Adsorption auf Antikörper-gekoppelten magnetischen Kügelchen als die durch Beschallung hergestellt, wenn verwendet, um ein endogenes Protein-Komplex zu reinigen. LAP-markierte 44 RBM7 wurde unter Verwendung der Affinität magnetische Kügelchen gekoppelt polyklonalen Anti-GFP – Antikörper erfasst die NEXT – Komplex 19,37 (D) zu reinigen von cryomilled Pulver – Extrakt; (E) Extrakte durch Beschallung von intakten Zellen. Die vertikale schwarze Balken hebt einen Bereich des Gels, wo eine hohe Masse nicht-spezifischen Interaktionspartner beobachtet werden in der Probe durch Beschallung hergestellt angereichert werden. Die schwarzen Pfeile die erwarteten spezifischen Interaktionspartner angezeigt (markiert). Bands beobachtet ~ 50 kDa in den Spuren D und E zu Lama IgG schweren Ketten zurückzuführen. (II) Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamid – Gel. (Std.) Ein Mock Affinitätseinfangen erfolgt auf HEK-293T-Zellextrakten in üblicher Weise. Nach Erfassung, Elution des gebundenen Materials wurde mittels (N) nicht denaturierenden Elution mit 1 mg / ml 3xFLAG Peptid oder (D) Denaturieren Elution in SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst; (PB 1) als Std. aber die 3xFLAG Peptid wurde in der Extraktionslösung bei 1 & mgr; g / ml enthalten die α-FLAG Paratope auf dem Affinitätsmedium zu blockieren; (PB 10) als PB1, jedoch in Gegenwart von 10 ug / ml Peptid 3xFLAG. IgG-bezogenen Bands und 3xFLAG Peptid markiert sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: PTFE – Isolator Sleeve-and-Puck. Ein 250 ml – PTFE Gefäß wird (1) gezeigt. Ein 50 ml – Edelstahl – Fräsen Glas (2) passt in der PTFE – Glas (3) und stellt dieGelegenheit, das Fräsen Glas in der Mühle zwischen den Zyklen installiert zu verlassen. Ein oberer PTFE – Isolator Puck (2) zwischen der Klemmvorrichtung und der Behälterdeckel verwendet. Direkt in den Körper des Isolators Um die installierten Glas und Isolatoranordnung abkühlen (3), LN 2 zugegeben, das Gefäß umgibt. Der nächste Zyklus des Mahlens kann dann eingeleitet werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Reagens Empfohlene Konzentration Notizen Kochsalz 0,1-0,5 M Hohe Konzentrationen (> 300 mM) neigen dazu, Extraktion des Gesamtproteins zu verbessern und Hintergrund gering zu halten, können aber eine ansonsten stabile inter abstreifenAkteure. Konzentrationen unter 150 mM sind typischerweise nicht wirksam bei nicht-spezifischen Hintergrund zu reduzieren. Ammoniumacetat 0,2-2 M Ein Salz, bestehend aus zwei Puffern, das ergibt einen neutralen pH – Lösung 57. Höhere Konzentrationen stabilisieren einige Proteinkomplexe. Saure Lösungen können aus alten, unsachgemäß gelagert kristallinen Bestände aufgrund von Ammoniakverlust zur Folge haben. Kein zusätzlicher pH-Puffer oder Salze werden in Extraktionsmittel enthält, Ammoniumacetat erforderlich. Kann mit NaCl kombiniert werden, erhalten zu modulieren Ergebnisse. Tween 20 0,1% v / v Ein nicht-ionisches Detergens 58; typischerweise mit NaCl kombiniert. Triton X-100 0,5-1% v / v Ein nicht-ionisches Detergens 58; typischerweise mit entweder NaCl oder NH kombiniert 4 CH 3 CO 2 H CHAPS 5 mM Ein zwitterionisches Waschmittel 58 </ Sup>; typischerweise mit NaCl kombiniert. Sarkosyl 1 mM Eine anionische Reinigungsmittel 58, der Hintergrund reduziert und kann eine stabile komplexe Bauteile abzustreifen, möglicherweise binäre Konnektivität enthüllt; typischerweise mit NaCl kombiniert. Tris-Cl 20 mM pK a von 8,8 bei 4 ° C, 8,1 bei 25 ° C. (PH 8,0) HEPES-Na 20 mM pK a von 7,8 bei 4 ° C, von 7,5 bei 25 ° C. NaOH oder KOH verwendet für pH Äquilibrierung in Abhängigkeit von dem Salz (beispielsweise NaCl, KCl oder CH 3 CO 2 K) in dem Extraktionsmittel verwendet. (PH 7,4) Tabelle 1: Einige vorgeschlagen Reagenzien , die für Proteinkomplexe zu reinigen. Diese Tabelle lists einige Reagenzien wir zur Reinigung von Proteinkomplexen nützlich aus menschlichen Zelllinien, mit den vorgeschlagenen Arbeitskonzentrationen gefunden. Eine typische Formulierung enthält Extraktionsmittel einen pH – Puffer, ein Salz und ein Detergens 1,11,24,45-48. Am günstigsten ist es die am wenigsten komplexe Kombination von Reagenzien zu identifizieren, die das gewünschte Ergebnis liefert. Abbildung S1: Mischen Sie nach der Reinigung (MAP-) SILAC Analyse von False Positives. I. Schematische Darstellung: In diesem Experiment 3xFLAG-markierte ORF2p Proteinkomplexe (von pLD401 ausgedrückt) wurden gereinigt von Schwer- und Leicht markierten HEK-293T – Zellen 7. Das Licht markierte Zellextrakt wurde mit 3xFLAG Peptid gespickt Affinität Erfassung des 3xFLAG-markierten ORF2p durch kompetitive Hemmung zu verhindern; dies wird nicht erwartet, dass die Bindung von Proteinen zu blockieren, die nicht-spezifi auftreten kanntisch mit dem magnetischen Medium oder den nicht paratopischen Strukturen des Antikörpers. Nach der Elution von den magnetischen Kügelchen, waren die schweren und leichten Proben gemischt Nachreinigung und analysiert durch quantitative MS (MAP-SILAC 39) den Anteil von Proteinen zu bestimmen , entweder mit Probe verbunden sind ; weitere methodische Detail befindet sich in der Tabelle S1. II. Silber gefärbtes Gel veranschaulicht, dass die Leicht- und Schwer markierten Materialien ergeben vergleichbare Ergebnisse (vergleiche mit L H), und daß die Reinigung in Gegenwart des spike in 3xFLAG durchgeführt (LI) war kompetitiv gehemmt. Im Folgenden wird ein Coomassie Blue G-250 gefärbtes Gel Topfen , bestehend aus dem gemischten H und LI Fraktionen vor Gelbasis Proteomanalyse, wie in Tabelle S1 beschrieben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zum Download bereit . Tabelle S1:MAP-SILAC. Dieses Blatt enthält die erhaltenen Daten bei der Ausführung des MAP-SILAC Experiment in Abbildung S1 beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um diese Tabelle zum Download bereit .

Discussion

Diese drei Protokolle arbeiten im Tandem (1) bereiten Zellen für Festkörperbruch durch Cryomahlung, (2) erreichen Bruch in einer Planetenkugelmühle, und (3) erzeugen Extrakte aus Zellpulver capture ein Protein von Interesse in Komplex Affinität seine physiologische Interaktoren. Viele verschiedene Zell – Lyse Techniken existieren, einschließlich der mechanischen / physikalischen Ansätze unter Verwendung von Brech Auswirkungen, Scheren, und / oder Druck, sowie chemische / enzymatische Ansätze, die jeweils mit unterschiedlichen Vor- und Nachteile 49,50. Jeder Ermittler wird ermutigt , Methoden am besten geeignet für ihre Analysen zu erforschen, wenn man bedenkt, dass jeder gewählte Ansatz für Zellbruch und Proteinextraktion ist wahrscheinlich Verzerrungen einzuführen 51,52 erfordert empirische Optimierung (siehe unten). Mechanische Verfahren können hohe Wärme und / oder Scherkräfte erzeugen, die Proteinkomplexe stören können. Cryomahlung vermeidet Erwärmungseffekte durch LN 2 Kühlung der Proben für die t Einsatzer die Dauer des Prozesses. Planetenkugelmühlen verstanden beim Aufprall und Reibungskräfte zu stützen, einschließlich Scherspannung, als Komponenten von Teilchengrößenverringerung 53,54. Bei den Einstellungen berichteten wir haben nicht Degeneration von Proteinkomplexen beobachtet. Tatsächlich haben wir extrahiert und abgerufen anscheinend intakt ~ 50 MDa Kernporenkomplexe 11 und enzymatisch aktiven Retrotransposons ausstellenden höhere spezifische Aktivität als Zubereitungen "sanften" Waschmittel-Lyse – 7 verwendet. Chemische / enzymatische Verfahren der Zelllyse leiden unter der Einschränkung , dass der Inhalt der Zelle in einer in vitro Milieu freigesetzt werden, die die Zerstörung der Zellmembranen und strukturellen Makromoleküle unterstützt , aber nicht für die Aufrechterhaltung der Integrität des Proteinkomplexes (es geeignet sein , ) von Interesse. Häufig weder die Bestandteile der Komplexe mit dem Protein von Interesse gebildet wird, noch die Bedingungen benötigt die Ziel-Komplexe zu stabilisieren sindim voraus bekannt. Ein großer Vorteil von Solid-State-Fräsen ist, dass Bruch und Extraktion entkoppelt sind, Quellenmaterial ermöglicht, frei von zugesetzten Flüssigkeit gelagert (bei -80 ° C oder darunter), angehäuft und bequem abgerufen für On-Demand-Experimente vorbereitet zu sein; zB zu erforschen in vitro Bedingungen für Affinitätseinfangen optimiert. Protein – Wechselwirkungen sind am stabilsten bei hoher Konzentration 55,56, also das Volumen an Extraktionsmittel minimiert werden können zur Konservierung von physiologischen Wechselwirkungen vorteilhaft sein. Auf der anderen Seite gibt es praktische Erwägungen – die Proteinkomplexe aus den Zellen aufgetrennt werden müssen und in eine nicht-viskosen wäßrigen Phase, frei von unlöslichen Aggregaten, um die Ziel-Komplexe mit dem Affinitätsmedium zu mischen. Darüber hinaus einige Standardisierung und Kontrolle über die in vitro – Umgebung (pH, Salzkonzentration, etc.) ist für Systematisierung und Reproduzierbarkeit benötigt. Wir finden, dass Extrakte produced im Verdünnungsbereich von 1: 4-1: 9 (w: v) erfüllen praktische und theoretische Anliegen, qualitativ hochwertige Ergebnisse liefert. Zusätzlich Extrakt der optimale Anteil von Zellmedium Bedürfnisse Affinität zu bestimmen. Dies wird empirisch durch Titration von Extrakten mit unterschiedlichen Mengen an Affinitätsmedium durchgeführt und nachweisbaren Wirkungen auf das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Experiments haben kann, weiter unten diskutiert. Eine ausgezeichnete Abreicherung des Zielproteins ist typischerweise ≥70% der löslichen Fraktion des Zielproteins, aber> 90% ist wünschenswert und kann bei sorgfältiger Parametrisierung der Extraktionsbedingungen erreichbar sein. Viele solche praktischen Erwägungen sind in Bezug auf die 1 abgedeckt. Paramagnetische Perlen werden unter Verwendung von Neodym-Magneten in einem spezialisierten Mikrorohrhalter manipuliert, obwohl hausgemachte Alternativen lebensfähig sind. Wenn innerhalb des Halters angeordnet ist, sammeln Perlen an der Seite des Rohrs unter dem Einfluß des Magnetfeldes. Die Lösungen können dann ohne di entfernt werdenstörendes, die Perlen.

Eine Einschränkung des präsentierten Kryomahlen Protokoll, entwickelt mit der Planetenkugelmühle verwendet hier (siehe Tabelle of Materials), ist , dass eine minimale Menge an Material benötigt wird , um effektiv Mühle und erholen Zellpulver mit diesem Gerät (> 1 g). Solche Mengen sind leicht mit vielen Mikroben, Zelllinien und Modellorganismen, und auch oft mit Gewebe von Versuchstieren ausgeschnitten erreicht werden. Jedoch können bestimmte Zelllinien sehr schwierig sein, in Hülle und Fülle und tierischen Geweben wachsen kann knapp werden. Kleinere Mengen von Material vergleichbar ist mit anderen Geräten verwendet kleinere Behälter gefräst, auch wenn er möglicherweise auf das Opfer des Pulverfeinheit erreicht. Darüber hinaus werden die Kosten für die mechanischen Mahlvorrichtungen können unerschwinglich teuer für einige Laboratorien. Kryomahlen kann 14-19, einschließlich die meisten affordably von Hand mit einem Schädling unter Verwendung einer Anzahl von alternativen Konfigurationen erreicht werdenle und Mörtel, obwohl Brucheffizienz erheblich sinkt. Affinitätseinfang Protokolle zielen typischerweise für eine hohe Effizienz der Zelllyse maximale Proteinextraktion in die Lösung zu erleichtern, und somit die maximale Potenzial zur Erfassung der Zielproteinkomplexen. Auf der anderen Seite ist es für die Hefe in vitro Spleißen nachgewiesen Extrakte , die maximale Lyse nicht mit maximal in vitro biochemische Aktivität 57,58 gleichsetzen kann. Wir haben solche Probleme nicht in den Systemen beobachteten wir bisher getestet haben, und deshalb nicht einschränken gezielt unsere Zellbruch, wenn Cryomahlung. Dennoch sollte diese Möglichkeit berücksichtigt werden , wenn für die in vitro enzymatische Tests zu optimieren. Obwohl Kryomahlen ein hochwirksames Verfahren zum Brechen von Zellen ist, profitiert eine begrenzte Menge an Beschallung oft die Herstellungs homogenen Gesamtzellextrakten aus Säugetiergeweben, weil inhomogenen Aggregate manchmal durch visuelle Untersuchung beobachtet werden kann: typischerweisein Extraktionsbedingungen unter Verwendung von geringen Salz (100-300 mM) und nicht-ionisches Detergens (0,1 bis 1% v / v) -Konzentrationen zu moderieren. Da wir festgestellt, daß die Anwesenheit dieser Aggregate kann die Ausbeute und / oder Qualität der nachfolgenden Affinitätseinfangen reduzieren, setzen wir routinemßig Beschallung sie zu dispergieren (selbst wenn sie nicht mit dem bloßen Auge beobachtet). Die Aggregate sind konsistent mit agglomerierten Membranfragmenten, vergleichbar mit den vorher in Extrakten aus gemahlenen Hefezellen 58 berichtet. Beschallen wird auch in einigen Protokollen verwendet, um DNA zu scheren und Chromatin-Fragmente in die Lösung freisetzen, aber der Grad der Beschallung in diesem Protokoll angewandt nicht merklich Fragment DNA. Die begrenzte Verfügbarkeit (oder die hohen Kosten) eines ausgezeichneten Affinitätsligand oder Antikörper gegen das jeweilige Protein von Interesse kann ein weiteres Hindernis sein. Eine Vielzahl von im Handel erhältlichen Affinitätsreagentien genutzt werden kann, wenn das Modellorganismus genomische Tagging oder tr zugänglich istansfection mit ektopischer Expressionsvektoren, die Expression von Proteinen von Interesse als Affinitäts getaggt Fusionen ermöglicht. Allerdings hat sich die Produktion von kundenspezifischen Antikörpern zunehmend möglich und sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper lassen sich hervorragend in Affinität Capture-Anwendungen auszuführen. Diese vielen Überlegungen werden auch in grßerem Detail in Bezug auf 1 behandelt.

Beispiele, wie die Zell – Lyse – Methode und die Wahl der Affinitätsmedium können die Ergebnisse beeinflussen , sind in Abbildung 1 dargestellt. Beispiele von verschiedenen Extraktionsmitteln ausgeübten Effekte können in Referenzen 1,11,24 erkennbar. Da diese und andere experimentelle Parameter die Qualität der Affinitätseinfangen beeinflussen, was es schwierig macht FPs zu unterscheiden, Repositories von "Perle Proteome" und rechnerische Ansätze zur Beseitigung nicht-spezifische Verunreinigungen wurden bei der Identifizierung von FPs 40-43 zu unterstützen , entwickelt. Dennoch solche Ansätze nur substitute für eine optimale Probenvorbereitung in begrenztem Umfang 59. Best Practices Beobachtung und Optimierung empirisch die Affinität Capture Experiment wird die höchste Qualität Proben für die Downstream-Analysen liefern, weiter unten diskutiert. Eine leicht implementiert Praxis, die Reinheit der Probe verbessern kann, ist, nativen Elution. Einheimische Elution wird am häufigsten zu erhalten, die Affinität isolierten Proteinkomplex, intakt, für weitere Experimente verwendet; aber wie es häufig Probenreinheit verbessert, kann sie auch aus diesem Grund allein verwendet werden. Wie jedoch II in 1, Panel demonstriert, in dem Zellextrakt auf einer genauen Titration der Menge der Affinitätsmedium der Fülle des Zielproteins hängt die Fähigkeit der nativen Elution Probenreinheit verbessern kann – wenn das Medium im Überschuss nicht besetzte Paratope kann die off-Target-Anreicherung von FP-Proteine ​​beobachtet werden in den nativ eluierten Fraktionen ermöglichen. Mit den Reagenzien und Verfahren hier beschrieben, es hwie unsere Erfahrung, dass die größte einzelne Beiträger von FPs unseren Experimenten ist das markierte Protein selbst einmal aus dem Kontext der lebenden Zelle entfernt. (Fig. 1 Abschnitt II und Fig. S1). In solchen Fällen Elternzelllinie Kontrollen, die irrelevant Proteome in Abwesenheit des Antigens ergeben sind ohne praktischen Wert; ebenfalls für Tag-only oder Spike-in Kontrollen, aber das Zielantigen frei von irgendetwas sind. Deshalb, wenn praktisch wir I-DIRT 7,38, zu implementieren , die direkt um die Ansammlung von post-Lyse Protein – Wechselwirkungen mit quantitativen MS misst. Als 3.2.7 des Protokolls in Schritt erwähnt, Verfahren für native Elution wird verwendet, um mit den Details der Affinität System variieren. Nativer Elution wird am häufigsten durch kompetitive Verdrängung des markierten Proteinkomplex oder proteolytische Spaltung des Tags, die Freigabe des Komplexes aus dem Affinitätsmedium erreicht. Mehrere Affinität Systeme von kleinen Epitop-Tags enthalten existieren, for , die das Epitop selbst ist nützlich für kompetitive Elution der markierten Proteinkomplexe 60 als Peptid erhältlich. Ebenso sind mehrere Proteasen zur Verfügung , um spezifisch verwandtes Websites markierten Fusionsproteine 61 strategisch in Affinität platziert spalten. In Abhängigkeit von den Besonderheiten der ausgewählten Affinität Systemen kann die geeignete Elution Schema übernommen werden.

Im Allgemeinen erhalten die Qualität der Ergebnisse maßgeblich von der Qualität der Probenvorbereitung erheblich belastet werden. Es ist wichtig, sorgfältig und präzise durch die einzelnen Schritte dieser Protokolle zu arbeiten, und so schnell wie möglich, während Sorgfalt und Präzision. Es empfiehlt sich, die Aufteilung des Proteins von Interesse durch die einzelnen Schritte zu verfolgen, die Effizienz jeder Manipulation zu verstehen. Zum Beispiel: wie reichlich ist das Protein von Interesse in der Zelle oder eines Gewebes in Frage? Vielleicht ist das Protein untersucht (und seine Komplexe) wird eine Herausforderung sein Massen zu charakterisierenSpektrometrie aufgrund geringer Menge. Wenn die gereinigten Komplexe nachweisbar durch die allgemeine Proteinfärbung sind (etwa Nanogramm-Bereich) ist die Massenspektrometrie wahrscheinlich erfolgreich zu sein. Wenn das aufgenommene Protein von Interesse kann nur durch empfindliche verstärkten chemolumineszenten Western Blot (etwa Picogramm-Bereich) erfasst werden kann, ist die Massenspektrometrie weniger wahrscheinlich, um wirksam zu sein. Selbst wenn das Protein von Interesse in der Zelle reichlich vorhanden ist, wie reichlich ist es in der Zellextrakts? Hat das Protein Partition zu der Lösung, oder ist es im Pellet? Wenn letzteres kann eine neue Extraktionslösung entwickelt werden, dass die Erholung verbessern können. Sobald der Zellextrakt mit dem Affinitätsmedium kombiniert wird, wie effektiv erfasst das Protein? Hat das Protein bleiben durch nachfolgende Wäschen gebunden? Was ist mit anderen copurifying Proteine? Durch die Einsparung eines aliquoten jeder Probe an geeigneten Schritte des Protokolls diese Fragen leicht beantwortet werden können, in der Regel mittels Western Blot gegen das Protein von Interesseoder allgemeine Proteinfärbung, aber auch andere Assays können ebenfalls geeignet sein. jeder Schritt der Optimierung wird die Ausbeute und Reinheit der aufgenommenen Komplexe verbessern, obwohl es ein Kompromiß sein kann, in die Maximierung einer Eigenschaft oder der anderen durchgeführt werden.

Eine typische Anwendung von Affinitätseinfangen für viele Forscher ist Kandidat in vivo – Inter für eine kleine Anzahl von Proteinen von Interesse zu identifizieren; Diese Kandidaten werden üblicherweise zur Validierung durch orthogonale Ansätze in vivo unterzogen , die biologische Bedeutung der physikalischen Interaktionspartner zu demonstrieren. Affinitätseinfang wird auch durch Hochdurchsatz – Studien eingesetzt zu erzeugen Listen von Proteinen copurifying auf einem (fast) Proteom weit beobachtet, die Erleichterung Rechen Schlüsse mutmaßlichen über in vivo – Komplexen. Zahlreiche Beispiele für solche Studien können in der Literatur gefunden werden. Dieser Ansatz verzichtet auf die Optimierung der Bedingungen der Aufnahme für einen bestimmten Ziel zugunsten der Erforschung der Menschy Ziele; Als solche sind die abgeleiteten Komplexe sich selten vollständig intakt und hochreine in jeder gegebenen Probe entnommen. Vielmehr werden als Grundlage der Schlussfolgerungen 42 verwendet die Teil Überschneidungen in Zusammensetzungen zwischen zahlreichen deutlichen Affinitäts erfassten Proben beobachtet. Beide Ansätze beitragen wertvolle Daten zu unserem Verständnis des Interaktom. Dennoch ist ein großer Vorteil der Affinitätseinfang, dass es häufig die Möglichkeit anbietet, die Komplexe intakt und hoch gereinigter zu erhalten, vorausgesetzt, dass die Bemühungen das Verfahren zu optimieren, hergestellt werden. Wir glauben , dass die Zukunft des Ansatzes liegt die Leichtigkeit und Effizienz zu optimieren , um die Erfassung von endogenen Proteinkomplexe 11, für eine genauere Beurteilung der Skala der physiologischen Interaktoren und häufigere Verwendung in weiteren nachgelagerten biochemischen, enzymologischer und strukturelle Untersuchungen bei der Steigerung, zB verweist 7,9,23.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Professor Brian T. Chait für seine wertvolle Ratschläge, Unterstützung und Zugang zu MS-Geräten, sowie Ms. Kelly R. Molloy für einen ausgezeichneten technischen Support. Wir danken Frau Kelly Bare für die Unterstützung mit Lektorat. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH Zuschüsse P41GM109824, P41GM103314 und P50GM107632 unterstützt.

Materials

Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm^2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62×44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) Retsch custom order For cryomilling (II)
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5 – 2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)
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LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).
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