Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

1. Hücre Hasat ve Donma Çevrede 25,26 hücre hattı için uygun kültür koşulları kullanılarak, hücre materyalinin 1-8 g büyütün. Bu protokol referanslar 19,27,28 değiştirilmiş hücrelerin en fazla 8 gram (~ 10 9 hücreleri) için optimize edilmiştir. Tipik haliyle, ~ HEK-293 veya HeLa hücrelerinde 5 g yetiştirilen sekiz 500 cm2 kültürü plakalarına ~% 90 konflüansa elde edilebilir. DİKKAT: Bu protokoller ciddi kriyojenik yanıklara neden olabilecek sıvı azot (LN 2), kullanın. Don koruyucu giysi ve egzersiz uygun taşıma önlemleri. Büyük bir behere büyüme ortamı (atık) dökünüz. büyük dikdörtgen bir buz tavada buz üzerinde kültür çanak yerleştirin. kültür tabağına buzla soğutulmuş 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile 20 ml ilave edilir ve büyük bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak hücreleri serbest; 50 ml'lik bir tüpe hücreleri transferi, önceden buz üzerinde soğutulmuştur; Buz tüpü tutun. NOT: Tüm hücre için taşıma adımları transferi manipülasyonlar sırasında hücrelerin aşırı kesme önlemek için bir elektro-pipet seti için "düşük" ve 25 ml'lik pipet kullanın. 50 ml toplama tüpleri düzenleyin ve önceki işlemleri başlatmadan bir buz kovasının içinde PBS 1x. Aynı çanak buz soğukluğunda 1x PBS ilave 10 ml. Kalan hücreleri toplamak ve 50 ml tüp aktarabilirsiniz. Her yemek için tekrarlayın; farklı yemekler hücre süspansiyonları örnek sayısı ve plastik atıkları azaltmak için kombine edilebilir. Not: hücrelerin kendileri süspansiyon hacminin büyük bir bölümünü teşkil etmez, çünkü hücre süspansiyonu değerinde üç tabak, iki 50 ml'lik tüp içine birleştirilebilir. 50 ml'lik tüpler aslında nominal hacmi daha fazla tutun, çünkü sekiz tabak genellikle beş tür tüpler yayılmış olabilir. 1,000 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde, her pelletini. resu birleştirinspended peletler, 5 ila 50 ml başına tüpüne kadar, örnek sayısını azaltmak için. 1,000 x g'de, 4 ° C'de santrifüje 5 dak. Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde pelletini 20 ml şırınga pistonu çıkarın ve bir kenara koyun. şırınga meme Cap ve buna hücre süspansiyonu aktarın. 1,000 x g'de, 4 ° C'de, 50 ml bir tüp ve santrifüj 5 dakika içinde şırınga yerleştirin. Hücrelerin sadece üst tabakası kadar bir vakum tuzak sistemine bağlı bir ince uçlu pipet ile süpernatant aspire kadar emilmesini başlar. Bu ıslak hücre peleti ile sonuçlanır. , Şırınga kapağını açmak piston yerleştirin ve bir strafor kutu içinde bir LN 2 banyosunda tutulan LN 2 ile dolu büyük bir plastik beher, doğrudan hücreleri damla. Zorla şırınga kalan hücrelerin dalma. dökerek 50 ml tüpler için donmuş hücreleri aktarın. Gevşek fazla LN 2 buharlaşmasına izin tüpler kap; t tutun-80 ° C 'de hem gece boyunca karıştırıldı. Ertesi gün tam kapaklarını sıkıştırın. Dondurulmuş hücre cryomilling kadar -80 ° C 'de bu şekilde depolanabilir. NOT: sıkıca aksi takdirde aşırı basınç tüpü patlamasına neden olabilir, LN 2 gözle görülür buharlaştı öncesi tüm tüpleri kapatmayın. LN 2 fazla su ağırlık ekleyerek, hücreler malzeme üzerinde don birikimi neden olabilir harcanmış ve etkin öğütme üzerine protein konsantrasyonu azaltan sonra tüpleri kapanan değil. Dondurulmuş Hücre 2. kriyojenik bozulması NOT: freze ve manipülasyonlar için tüm araçlar LN 2 ile ön soğutulması gerekmektedir. Küçük bir dekanter kavanoz içinde LN 2 eklemek için kapalı freze kavanozun üstünden LN 2 dökme için gerekli olacaktır. Ev yapımı bir araç referansı 19 gösterilmiştir. Kriyojenik eldivenler LN 2 freze cihazı soğutmalı işlemek için gerekli olacaktır. değirmencilikBurada kullanılan kavanoz kapakları genellikle yüklü bir lastik conta ile birlikte (Malzeme Tabloya bakınız); Bu güvenilir aşağıdaki protokol yürütmek için piyasada mevcut olan teflon kapaklı conta ile değiştirilmesi gerekir. Gaz N2 basınç öğütme sırasında kavanoz içinde yüksek seviyelere kadar inşa edebilirsiniz, çünkü Dahası, biz bir güvenlik önlemi bırakma 28 olarak piyasada mevcut 5 bar / 500 kPa basınç valfi yüklemenizi öneririz. -80 ° C depolama hücre boncuk çıkarın ve bir LN 2 banyosunda 50 ml'lik bir tüp tutucu tutun. LN 2 içeren bir temiz dikdörtgen buz kovası, 50 ml kavanoz, iki adet 20 mm'lik topları ve kapağı ön serin. birini kullanarak, eğer politetrafloroetilen (PTFE) yalıtkan önceden soğutmak; Ya diskleri bir dizi (27 referans bakınız) ya da bir kol ve-cin (bakınız Şekil 2). Ön soğutma işlemi tamamlandığında LN 2 yatıştırır şiddetli kaynama. Set uygun dengedeğirmen. NOT: Bu kavanoz, kavanoz kapağı kütlesine eşit olacaktır, freze topları kullanılan ve hücrelerin miktarı kavanoza eklenecek. herhangi bir PTFE izolatörler kullanılması halinde, kitlesel de dahil edilmelidir. Biz kavanoz, kapağın kitleleri kayıt ve önceden (kullanılan herhangi izolatör dahil ve bunların kombine kütlesi) ve değirmen yakın saklanan bir bilgi kağıda bunları kayıt topları öneririz. forseps kullanarak, önceden soğutulmuş freze kavanoz içinde iki önceden soğutulmuş 20 mm freze topları ve donmuş hücreleri yerleştirin. Not: nedeniyle öğütme sırasında kavanoz ve top yüzeylerde malzemenin küçük kayıpları artar öğütülmüş hücrelerin kütlesi olarak geri malzeme artar yüzdesi. tarif edilen yöntemle, malzeme kayıpları ~ 0.3 g ıslak hücre ağırlığı (WCW) sırasına olmak, çok mütevazı. Üreticinin kurallar numunenin maksimum hacim kavanoz hacmi ~ 1/3 olmalıdır yüklenen gösterir. 29 topları toplam hacmi ~ 1/3 ve r olmalıdıremaining ~ 1/3 boş alan topları serbest dolaşımı içindir. ~ ½ tam kavanoz up LN 2 Ekle, kavanozun kapağı yerleştirin ve değirmene aksamını aktarın. NOT: birini kullanarak Öncelikle seçilen izolatörü yükleyin. ters-rotasyon yönünü her dakika, hiçbir aralık sonu, 400 rpm, 3 dakika: yerinde montajını Kelepçe ve aşağıdaki programı kullanarak öğütme üç kür gerçekleştirin. Her çevrimde arasında LN 2 ile freze kavanoz soğutun. NOT: topları gezegensel hareket kavanoz içinde çarpışır olarak ayrı bir clunking gürültü oluşturulur freze sırasında. Bu sesler duydum değilseniz, freze meydana gelmiyor. Kavanoz içeriğini, bu döngüyü saymak geri LN 2 kavanoz düzeneğini taşımak ve incelemek değil, freze döngüsünü sona erdir. kurdu hayır buz sağlamak ve varsa, önceden soğutulmuş spatula ile uzak kavanoz duvarlarından onu çip. Adım 2.5 den tekrar başlayın. Hiçbir izolatör veya yalıtkan diskleri kullanıyorsanız, geri kavanoz düzeneğini taşımak LN <sdöngüleri arasındaki ub> 2 serin yeniden ve tam her zaman ½ ~ için LN 2 ekleyin. LN 2 öğütme sırasında kavanoz sıcaklığı arttıkça kavanoz içinde buharlaşır ekledi. Bu kavanoz içindeki basınç birikmesi ile sonuçlanır. değirmen kavanozu boşaltırken, bu nedenle, çok yavaş kelepçe bırakın. kelepçe hızla bırakılırsa, hücre toz hızlı basıncın ile kaçabilir. kelepçenin yavaş salgılanan yumuşak, kontrollü bir şekilde kavanozdan kaçmasına basıncın ve hücre malzemesinin kaybını önler. Bu normaldir – gazlı N2 nazik kaçış genellikle kelepçe yavaşça serbest olarak tıslama duyulabilir. Bir kol-ve-cin yalıtkan kullanıyorsanız, kavanoz montaj değirmende sol ve LN 2 yerinde izolatör / kavanoz montaj eklenebilir. Geri LN 2 kavanoz taşıyın ve soğutmak için bir an dinlendirin. Bir manşon ve-diski yalıtkan kullanılıyorsa, kavanoz kol W çıkarılabilirher iki tarafta kaldıraç sağlayan iki spatula yardımıyla, i. Kavanoz LN 2 dinlenme sonra, dikkatlice forseps kullanarak topları kaldırmak, kapağı kaldırmak ve önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak önceden soğutulmuş 50 ml tüp toz transferi. Açık kavanoz / toz biraz LN 2 ekleme kaldırmadan önce, topları üzerine fırıncı olan toz çıkarmak için yardımcı olabilir. NOT: Kavanoz açıldıktan sonra, topları çıkarmadan önce ona LN 2 küçük bir miktar ekleyin. Bu yüzeylerde fırıncı toz kurtarmak için yardımcı olacaktır. Hücre tozu -80 ° C veya altında, kullanılıncaya kadar tutulmalıdır. Deneyimlerimize göre, hücre toz performansı etkilemeden, esas olarak sonsuza kadar bu şekilde saklanabilir. Hücre özleri Protein Kompleksleri 3. Affinity Yakalama NOT: Aşağıdaki protokol faiz, eş protein ile etkileşime afinite bir afinite ligandı oluşan medya, yem ya da antikor uygularparamanyetik boncuk ölçekli mikron için upled. Bu ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, in-house 19,30 hazırlanabilir ya da hazır reaktifler olarak satın alınabilir. Hücre ekstresi hazırlanması NOT: Hücre tozu tutarken, mutfak eşyaları ve tüpler LN 2 ile önceden soğutulmuş kullanmayı unutmayın. Hücre tozu içeren tüpler her zaman değil -80 ° C'de LN 2 tutulmalıdır. 50 ml tüp (ler) LN 2 plastik bir kap içinde, tüp raf hücre tozu içeren yerleştirin. 1.5 ya da 2 mi mikrofüj tüpe, hücre tozu 100 mg tartılır. NOT: hücrelerin bu miktar genellikle nanogram yüzlerce onlarca hedef proteini verecektir iyi bir başlangıç ​​noktasıdır başına kopya binlerce, bir orta ifade protein (~ 50 kDa kitle için afinite yakalama sonra mevcut aralığı olduğunu gözlemledim hedefin çıkarma ve yakalama verimliliği küstah hücresi), ≳70% bulunmaktadır. Bu tür verimler doğrudan visualiz sağlamakSDS-PAGE ve protein boyama ile saflaştırılmış fraksiyonunun yapımı. Boş mikrofuge'de tüp ile dara analitik terazi. Bir LN 2 kaşık veya spatula soğutmalı kullanarak bir tüp içine hücre tozu dağıtın. analitik terazi üzerinde tüp içinde dağıtılan toz kütlesini kontrol edin. NOT: Hücre tozların dışarı ağırlığında, küçük hacimsel ölçüm kaşık kullanılabilir kolaylaştırmak için. Bunlar (19 referans bakınız) tekrarlanabilir sonuçlar verdiği bulunmuştur. Biz vidalı kapak ya da 'güvenli kilit' mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak en iyi sonuçları bulduk. Potansiyel olarak örnek kaybı ile sonuçlanan – Standart mikrosantrifüj tüpleri hemen önce ekstre çözeltisine ilave edilmesinden sonra ısıtma sırasında açık pop neden olabilir tüpleri girebilir LN 2 buharlaştırma Basınç. tüp açın (veya vidalı kapağı gevşetin) hücre tozu ile ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bu tüp içindeki basıncı serbest bırakmak ve ekstraksiyon hemen donmaması olacakÇözelti, tozun ilave edildi. Hiçbir çözülme bu 1 dakika inkübasyon sırasında görülmektedir. 3.1.5 adımına geçilmesi sırasında kısa bir süre için, daha sonra buz üzerinde tutmak proteaz inhibitörleri ve vorteks ile takviye özümleme 400 ul ekle. Numuneler elüsyon kadar daha sonraki tüm manipülasyonlara arasında buz üzerinde tutulmalıdır. Not: özütleyici iyi bileşim olup protein kompleksi (ES) bağlıdır arıtılacak. Bazı genel bilgi, Tablo 1 ve destek referanslarda verilmektedir. örnek, herhangi bir agrega dağıtmak için kısa bir düşük enerji darbe vermek için bir mikrotip ultrasonikatör kullanın. 4 bakliyat (2 saniye her 2 A; toplam enerjinin yaklaşık 15-20 J) ile (Ultra) sonikasyon. NOT: Vorteks özümleme içine hücre tozu dağıtır, ama çözüm karakterine bağlı olarak, bazı büyüklükler görülebilir. Biz bu agrega dağıtma sonraki afinite çekimi sırasında en iyi verimi sağladığını bulmuşlardır. Kısa bir mikro uçlu sonikatyon kolayca bu agrega dağılır. Çözüm açık agrega olmadan, yarı saydam, ancak homojen görünmelidir. Su banyosu sonicators verimli önemli ölçüde daha uzun numune alma süreleri olmadan bu tür agrega dağıtmak için çok düşük güç olma eğilimindedir, ancak uygun ayarlarla uygun olabilir. Santrifüj ile özü netleştirmek (örneğin, 20,000 xg, 10 dakika, 4 ° C). Not: berraklaştınlmış hücre Özütün bir alikotu, pelet, post-afinite yakalama yüzer içeriğine karşılaştırma için kaydedilebilir ve afinite ortamının elüsyonundan sonra, elde edilen fraksiyonlar, hedef proteinin ekstre etkinliğini ve yakalama belirlenmesi örneğin, Western blot ile (tartışma). süpernatant (açıklık ekstresi) çıkarın ve afinite yakalama geçin. Not: pelet, hedef protein D'salım derecesini belirlemek için, 70 ° C 'de, SDS-PAGE numune yükleme tamponu içinde yeniden ekstre edilebilirAşama 3.1.6 'de elde edilen ekstrakt ile karşılaştırıldığında, başlangıç ​​denatüre edici olmayan ekstraksiyon uring. Affinity Yakalama Manyetik afinite orta ön yıkama. Hücre ekstreleri santrifüj edilirken bu yapılabilir. mıknatıs tüpü (ler) yerleştirin. boncuklar kaldırılacak depolama çözümü izin, saniyeler içinde tüpün tarafında birikir. tanelerine ekstraksiyon çözeltisi 500 ul ekle. orta hızda Kısaca vorteks karışımı (tekrar süspansiyon için yeterli). alt tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Aksi takdirde çözümler asgari taşınmasını sağlar. mıknatıs tüpler yerleştirin ve çözüm aspire. NOT: ayırt edici özelliklere sahip Manyetik medya ticari tedarikçiler geniş bir yelpazede temin edebilirsiniz. Sonuçlar boncuk büyüklüğü, bütünlüğü, yüzey kaplama ve antikor birleştirme kimyası da dahil olmak üzere, bu özelliklere bağlı olarak değişebilir. Side-by-siuygulamanızda de çalışmalar bir seçim ayıracı yerleşmeden önce tavsiye edilir. tekrar süspansiyon kısaca önceden yıkanmış afinite orta ve vorteks içeren bir 1.5-2.0 ml tüp açıklık hücre ekstresi aktararak afinite yakalama başlatın. çevirici tekerlek sürekli hafifçe karıştırılarak, 4 ° C 'de 30 dakika boyunca inkübe edin; boncuk inkübasyon boyunca asılı kalmalıdır. tüpün dibine tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Süpernatant aspire ve aşama 3.2.3 de tarif edildiği gibi, soğuk ekstraksiyon çözeltisinin 1 ml'si ile boncuk üç kez yıkayın. mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. çözüm çıkarın. sonraki çözümü eklemek ve tekrar devam edin. 2. Yıkama sırasında, pipetleme yeni bir mikrofüj tüpe birlikte boncuklar ve yıkama solüsyonu aktarın. Bu T ile inkübasyon için kullanılan tüpün duvarlarına adsorbe rastgele proteinleri tarafından, elüsyon noktada numune kontaminasyonu azaltıro özü hücre. 3. yıkamadan sonra, boncuklar altına tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj darbe bükülmüş kısaca olmalıdır. geri mıknatıs tüp yerleştirin ve kalan sıvı kaldırmak. Bu, elüsyon homojen hacimli olacaktır elüt örnekleri sağlanması önce çözeltinin son birkaç ul kaldırılmasını mümkün kılar. Aynı zamanda elüsyon çözümü artık yıkama seyreltilmiş olmayacak gibi sağım, etkili olacak sağlar; bu kalıntılar, aynı zamanda bir tuzu etkilerine katkıda (aşağıya bakınız), SDS-PAGE protein göçünü değiştirebilir. Not: sonrası bağlayıcı Yüzer kısımdan bir şişe 3.1.6 oluşturulan açıklık ekstresine karşılaştırma için kaydedilebilir. western blot ile. Sonuç hücre özütünden hedef proteinin tükenmesi derecesini gösterir. ya bir doğal veya denatüre edici bir şekilde elüte; alt uygulama 1 için en iyi strateji düşünün. NOT: Yerli elüsyon Strategie ayrıntılarıs kullanılan afinite etiketi (Tartışma bakınız) bağlıdır. Protein lekeleme 31 SDS-PAGE ile numunenin analizi ile takip edilen SDS-PAGE örnek tamponu ile elüsyon denatüre çoğu kullanıcı için, en pratik ilk yaklaşım olacaktır. NOT: elektroforez sistemi bağlıdır örnek tampon bileşimi kullanılır. Birçok laboratuarları süreksiz elektroforez ve Laemmli tampon sisteminin 32-34 yararlanarak, kendi Tris-glisin jeller attı. Ortak bir örnek tampon tarifi (1x) içerir:% 10 sukroz, 50 mM DTT,% 2 Blue SDS (w / v), 62.5 mM Tris-CI pH 8.8,% 0.0004 (ağırlık / hacim) bromofenol 31 (w / v) . Biz DTT atlar bir 1.1x stok hazırlanıyor öneririz. 500 mM DTT hacmi SDS-PAGE önce örnek eklenmelidir inci 1/10 (aşağıya bakınız). Pek çok ticari olarak temin edilebilir, SDS-PAGE sistemi de mevcuttur; Bu sistem özel numune tamponları içerebilir. serbest azaltmak için (indirgeme maddesi SDS-PAGE numune tampon eklemeboncuklardan antikor zincirlerinin) ve çalkalama ile oda sıcaklığında 5-10 dakika süreyle inkübe edin. NOT: Bu süpernatant içine çekilen proteinleri serbest, çoğu afinite bazlı etkileşimleri müdahale edecek. Daha kalıcı etkileşimler serbest bırakılması için yüksek sıcaklık yararlanabilir (tipik olarak 70 ° C yeterlidir). Toplamak ve süpernatant kaydedin. Numuneler kısa bir depolama için -20 ° (birkaç gün) dondurulabilir veya -80 uzun depolama ° C Analiz istendiği kadar. Standart teknikler 31 kullanılarak protein boyama ile takip edilen SDS-PAGE numune, öznenin. MS numune bileşimi 1 karakterize etmek için kullanılabilir. Bağımsız protein bantları tanımlanması için eksize edilebilir ya da tüm örnek, yalnızca kısa bir süre için (jele 4-6 mm) örnek elektroforeze ve bir araya numunedeki tüm proteinlerin işlenmesi tek bir analizde, özelliği edilebilir "jel yatağından. ' NOT: inisiyatif önce DTT ekleting elektroforezi. Planlama MS geçmek için, numuneler elektroforez 35 sonra alkillenebilir; Bununla birlikte, önceden elektroforez 36 alkillemek için sıklıkla daha uygundur.