Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.
captura por afinidad es una técnica eficaz para aislar los complejos de proteínas endógenas en estudio. Cuando se utiliza en conjunción con un anticuerpo, esta técnica también se refiere con frecuencia como inmunoprecipitación. captura por afinidad se puede aplicar en un a escala de banco y en un contexto de alto rendimiento. Cuando se combina con la espectrometría de masas de proteínas, de captura por afinidad ha demostrado ser un caballo de batalla de análisis interactome. Aunque hay potencialmente muchas maneras de ejecutar los numerosos pasos a seguir, los siguientes protocolos implementan nuestros métodos favorecidos. Dos características son distintivos: el uso de polvo de células cryomilled para producir extractos de células y perlas paramagnéticas de anticuerpos acoplados como el medio de afinidad. En muchos casos, se han obtenido resultados superiores a los obtenidos con las prácticas de captura de afinidad más convencionales. Cryomilling evita numerosos problemas asociados con otras formas de rotura celular. Proporciona rotura eficiente del material, evitando al mismo tiempo denatURACIÓN problemas asociados con el calentamiento o la formación de espuma. Conserva la proteína nativa concentración hasta el punto de extracción, la mitigación de la disociación macromolecular. Se reduce el tiempo de proteínas extraídas pasan en solución, lo que limita las actividades enzimáticas deletéreos, y puede reducir la adsorción no específica de proteínas por medio de afinidad. medios de afinidad magnética a escala micrométrica se han convertido en algo común en los últimos años, reemplazando cada vez más la agarose- tradicional y los medios de comunicación basados en Sepharose. Los beneficios primarios de medios magnéticos incluyen la adsorción de proteínas no específica generalmente más bajos; hay un límite de exclusión de tamaño debido a la unión de proteínas complejas se produce en la superficie del grano en lugar de dentro de los poros; y la facilidad de manipulación y el manejo de uso de imanes.
Una aplicación típica de los procedimientos presentados es estabilizar y obtener un alto rendimiento y la pureza de los complejos de proteínas endógenas de interés para la caracterización interactomic 1. Se entiende que las redes dinámicas de ambos complejos macromoleculares asociados de forma estable y transitoriamente, principalmente compuesto de proteínas, orquestan procesos celulares 2,3. Si bien hay muchos enfoques experimentales para identificar interacciones proteína-proteína, la captura por afinidad es uno de los métodos más utilizados para el aislamiento y la disección de los complejos de proteínas fisiológicas 4-6. Además, esta técnica tiene la ventaja de producir los complejos macromoleculares como entidades físicas, no sólo como puntos de datos en una lectura; Ventajosamente, los complejos obtenidos de este modo pueden ser utilizados en una serie de bioquímica adicional aguas abajo, enzimáticos y ensayos estructurales 7-9. Los protocolos presentados se han desarrollado en respuesta a la necesidad de asignar proteilas redes de interacción de proteínas-n y caracterizar los complejos macromoleculares en su papel de las moléculas efectoras de la biología celular. Son detallada con respecto a su aplicación a las células de mamífero cultivadas en cultivo de tejidos, pero son igualmente aplicables a una amplia gama de muestras biológicas dadas ajustes específicos del sistema adecuadas.
La historia de la captura por afinidad se remonta a principios del siglo XX con los primeros experimentos de cromatografía de inmunoafinidad – parecido a lo que comúnmente se denomina hoy en día como la inmunoprecipitación (IP) – aparecer en la literatura por la década de 1950. Uso generalizado de la técnica de desarrollarse mediante el cambio de siglo hasta la actualidad 10-13. Celular diverso y estudios de biología molecular han utilizado la rotura mecánica de las células mediante la molienda a temperaturas criogénicas durante al menos los últimos cuarenta años 14-19; y las separaciones moleculares que utilizan (super) perlas paramagnéticas tienen become cada vez más común en las últimas dos décadas 20. La combinación de estas diferentes tecnologías ha servido para mejorar sinérgicamente los resultados que se pueden obtener en los experimentos de la proteína compleja de captura por afinidad 1, como se evidencia por un extenso cuerpo de trabajo producido por nosotros mismos y la comunidad de investigación más amplio 7,9,11,18,19,21 -23. Resultados de apoyo se presentan en la Figura 1.
Una colección de advertencias y consideraciones aplicables a la ejecución de experimentos de captura de afinidad eficaces se puede encontrar en la referencia 1. Normalmente, este enfoque es más adecuado para: (I) catalogar los interactores de una proteína de interés, es decir, utilizar la proteína espectrometría de masas (MS) para identificar proteínas copurifying hasta ahora desconocidos (análisis exploratorio); Ensayo (II) para la presencia de una interacción socio particular, es decir, el uso de MS o de transferencia de Western para detectar una proteína en particular o un conjunto limitado de proteínas se sospecha que eninteractúan con la proteína de interés (prueba de hipótesis); o (III) preparar complejos de proteína endógena ensamblados que contienen la proteína de interés para su estudio mediante técnicas adicionales (estudio diagnóstico preparativa). Antes de embarcarse en un régimen experimental de captura por afinidad es absolutamente indispensable contar con un reactivo de afinidad de alta calidad que se une a la proteína diana, típicamente un anticuerpo IP-competente contra la proteína diana nativo de interés o en contra de una etiqueta anexada a una proteína de fusión. También es fundamental contar con métodos apropiados de lectura experimental en su lugar: tinción de proteínas en general (como el azul de Coomassie, Sypro Ruby, o plata, después de SDS-PAGE), Western Blot, y la proteína de la EM son comúnmente utilizados en conjunción con la captura por afinidad 1. Los protocolos presentados utilizan perlas magnéticas conjugados de anticuerpos como el medio de afinidad. Mientras que la función del medio de afinidad inicialmente puede ser validado en ensayos que utilizan unos parámetros experimentales, aobtener los mejores resultados de cada experimento debe ser empíricamente optimizado 1,11,24. Los protocolos se dividen en tres fases distintivas: (1) la preparación de material celular congelado; (2) rotura celular por molienda en estado sólido a temperatura criogénica; y (3) la extracción de proteínas y la captura de afinidad utilizando perlas paramagnéticas de anticuerpos acoplados.
Estos tres protocolos funcionan en tándem para (1) preparar células para la rotura de estado sólido por cryomilling, (2) lograr la rotura en un molino de bolas planetario, y (3) producir extractos de polvo de la célula a la afinidad de captura de una proteína de interés en el complejo con sus interactores fisiológicas. Existen muchas diferentes técnicas de lisis celular, incluyendo enfoques mecánicos / físicos que emplean la trituración de impacto, cizallamiento, y / o la presión, así como enfoques químicos / enzimáticos, cada uno con diferentes ventajas y desventajas 49,50. Se anima a cada investigador para explorar métodos más adecuados para sus análisis, teniendo en cuenta que es probable que introducir sesgos 51,52 necesitando una optimización empírica (véase más adelante) cualquier enfoque elegido para la rotura de células y la extracción de proteínas. Los métodos mecánicos pueden producir altas temperaturas y / o fuerzas de cizallamiento que puede interrumpir los complejos de proteínas. Cryomilling evita efectos de calentamiento por virtud de emplear LN 2 enfriamiento de muestras para tque la duración del proceso. Molinos de bolas planetarios se entiende que depender de impacto y fricción fuerzas de cizallamiento, como el estrés, como componentes de la reducción del tamaño de partícula 53,54. En la configuración informamos que no hemos observado la degeneración de complejos de proteínas. De hecho, hemos extraído y recuperado aparentemente intactas ~ 50 MDa complejos de poro nuclear y 11 por vía enzimática retrotransposones activos que presentan mayor actividad específica que las preparaciones que emplean lisis a base de detergente "suave" 7. Químicos / métodos enzimáticos de lisis celular sufren de la limitación de que el contenido de la celda se liberan en una vitro medio en el que apoya la alteración de las membranas celulares y macromoléculas estructurales, pero puede no ser adecuado para el mantenimiento de la integridad del complejo de proteína (es ) de interés. Con frecuencia, ni los componentes de los complejos formados con la proteína de interés ni las condiciones necesarias para estabilizar los complejos de destino sonconoce de antemano. Una ventaja importante de la molienda en estado sólido es que la rotura y la extracción se desacoplan, permitiendo al material de origen pueden preparar de forma líquida añadido, almacenan (a -80 ° C o menos), amasaron, y convenientemente recuperados para la experimentación en la demanda; por ejemplo, para explorar optimizada en condiciones in vitro para la captura por afinidad. Interacciones de proteína son más estables a alta concentración 55,56, por lo tanto, reducir al mínimo el volumen de agente de extracción puede ser ventajoso para la conservación de las interacciones fisiológicas. Por otro lado, hay consideraciones prácticas – los complejos de proteínas necesitan ser particionada fuera de las células y en una fase acuosa no viscoso, libre de agregados insolubles, con el fin de mezclarse los complejos diana con el medio de afinidad. Por otra parte, se necesita cierto grado de normalización y control sobre el entorno in vitro (pH, concentración de sales, etc.) para la sistematización y la reproducibilidad. Nos encontramos con que los extractos de produced en el intervalo de dilución de 1: 4-1: 9 (w: v) satisfacer las preocupaciones prácticas y teóricas, produciendo resultados de calidad. Además, la proporción óptima de extracto celular a la afinidad necesidades a medio que se determine. Esto se hace empíricamente mediante titulación de extractos con cantidades variables de medio de afinidad y puede tener efectos detectables en la relación de señal a ruido del experimento, se analiza más adelante. Una excelente agotamiento de la proteína diana es típicamente ≥70% de la fracción soluble de la proteína diana, pero> 90% es deseable y puede ser alcanzable con cuidado parametrización de las condiciones de extracción. Muchos de tales consideraciones prácticas están cubiertos en la referencia 1. perlas paramagnéticas son manipulados usando imanes de neodimio en un soporte para tubos de microcentrífuga especializada, aunque las alternativas caseras son viables. Cuando se coloca dentro del soporte, las perlas se acumulan en el lado del tubo bajo la influencia del campo magnético. Las soluciones pueden entonces ser retirados sin disturbing las perlas.
Una limitación del protocolo cryomilling presentado, desarrollado con el molino de bolas planetario se utiliza aquí (véase la Tabla de Materiales), es que se requiere para efectivamente molino de una cantidad mínima de material y recuperar polvo celular utilizando este dispositivo (> 1 g). Tales cantidades se obtienen fácilmente con muchos microbios, líneas celulares, y organismos modelo, y puede también lograrse a menudo con los tejidos extirpados de los animales de laboratorio. Sin embargo, ciertas líneas de células pueden ser muy difíciles de cultivar en los tejidos de abundancia y animales puede ser escasa. Pequeñas cantidades de material pueden ser molidos comparable utilizando otros dispositivos que utilizan recipientes más pequeños, aunque potencialmente en el sacrificio de la finura del polvo obtenido. Además, el costo de los dispositivos mecánicos de molienda puede ser prohibitivo para algunos laboratorios. Cryomilling se puede lograr usando un número de configuraciones alternativas 14-19, incluyendo, más asequible a mano usando una plagaLe y el mortero, aunque la eficiencia de rotura se reduce considerablemente. protocolos de captura por afinidad típicamente apuntan a una alta eficiencia de la lisis celular para facilitar la extracción máxima de proteína en la solución y por lo tanto, el potencial máximo para la captura de los complejos de proteína diana. Por otro lado, se ha demostrado para la levadura en el empalme vitro extractos que la lisis máxima no puede equiparar con máxima en la actividad bioquímica vitro 57,58. No hemos observado este tipo de problemas en los sistemas que hemos probado hasta ahora, y por lo tanto no limitan a propósito de nuestra ruptura celular cuando cryomilling. Sin embargo, esta posibilidad debe tenerse en cuenta cuando se optimizan para los ensayos enzimáticos in vitro. Aunque cryomilling es un método muy eficaz para romper las células, una cantidad limitada de sonicación a menudo beneficia a los de producción de extractos de células enteras homogéneas de tejidos de mamíferos ya que los agregados no homogéneas a veces pueden observarse por inspección visual: típicamenteen condiciones de extracción usando baja en sal (100 a 300 mM) y un detergente no iónico (0,1 a 1% v / v) concentraciones a moderada. Debido a que se observó que la presencia de estos agregados puede reducir el rendimiento y / o calidad de la captura por afinidad posterior, de manera rutinaria en práctica sonicación para dispersar ellos (incluso cuando no se observan a simple vista). Los agregados son consistentes con fragmentos de membrana aglomerados, comparables a los reportados previamente en extractos de células de levadura molidas 58. La sonicación también se utiliza en algunos protocolos para cizallar el ADN y liberar fragmentos de cromatina en la solución, sin embargo, el grado de la sonicación aplicado en este protocolo no hace apreciablemente fragmento de ADN. La disponibilidad limitada (o el alto coste) de un excelente ligando de afinidad o anticuerpo contra la proteína particular de interés puede ser otro impedimento. Una amplia gama de reactivos de afinidad disponibles en el mercado puede ser aprovechada cuando el organismo modelo es susceptible de etiquetado genómico o transfection con vectores de expresión ectópicos, que permiten la expresión de proteínas de interés como fusiones de afinidad de etiquetado. Sin embargo, la producción de anticuerpos personalizados se ha convertido en cada vez más factible y ambos anticuerpos policlonales y monoclonales puede realizar de manera excelente en aplicaciones de captura de afinidad. Estas muchas consideraciones también se tratan en mayor detalle en la referencia 1.
Ejemplos de cómo el método de la lisis celular y la elección de medio de afinidad pueden afectar los resultados se ilustran en la Figura 1. Ejemplos de efectos ejercidos por diferentes agentes de extracción se pueden ver en las referencias 1,11,24. Debido a estos y otros parámetros experimentales afectan a la calidad de la captura por afinidad, por lo que es difícil discriminar los PM, y los repositorios de proteomas "talón" y métodos de cálculo para eliminar los contaminantes no específicos han sido desarrollados para ayudar en la identificación de los MF 40-43. Sin embargo, tales enfoques sólo substitUTE para la preparación de la muestra óptima en un grado limitado 59. La observación de las mejores prácticas y empíricamente optimizar el experimento de captura por afinidad proporcionará las muestras de la más alta calidad para los análisis posteriores, se analiza más adelante. Una práctica fácil de implementar que puede mejorar la pureza de la muestra es de elución nativa. elución nativo se usa con mayor frecuencia para obtener el aislado complejo de proteínas de afinidad, intacto, para la experimentación adicional; pero ya que con frecuencia mejora la pureza de la muestra, puede también ser utilizado sólo por esta razón. Sin embargo, como se demuestra en la Figura 1, el panel II, la capacidad de elución nativo para mejorar la pureza de la muestra puede depender de una valoración precisa de la cantidad de medio de afinidad a la abundancia de la proteína diana en el extracto celular – cuando el medio se encuentra en exceso , paratopes desocupadas pueden permitir la acumulación fuera del objetivo de las proteínas de PF observables en las fracciones eluidas de forma nativa. Utilizando los reactivos y procedimientos descritos aquí, hcomo nuestra experiencia, la única gran colaborador de los programas marco de nuestros experimentos es la propia proteína de la etiqueta una vez retirado del contexto de la célula viva. (Fig. 1.II y la Fig. S1). En tales casos, los controles de la línea de células parentales que producen proteomas irrelevantes en ausencia del antígeno no tienen ningún valor práctico; Lo mismo sucede con la etiqueta de sólo o espiga-en los controles que están desprovistos de cualquier cosa menos el antígeno diana. Por lo tanto, siempre que sea práctico ponemos en práctica I-SUCIEDAD 7,38, que mide directamente la acumulación de post-lisis interacciones de proteínas utilizando MS cuantitativos. Como se mencionó en el paso 3.2.7 del protocolo, los procedimientos para la elución nativa variarán con los detalles del sistema de afinidad utilizada. elución nativo se consigue con mayor frecuencia por desplazamiento competitivo de la proteína marcada de escisión proteolítica compleja o de la etiqueta, la liberación del complejo desde el medio de afinidad. Existen varios sistemas de afinidad que comprenden etiquetas de epítopo pequeñas, for que el epítopo en sí está disponible como péptido útil para la elución competitiva de complejos de proteínas etiquetadas 60. Del mismo modo, varias proteasas están disponibles para escindir específicamente sitios afines colocados estratégicamente en la afinidad etiquetados proteínas de fusión 61. Dependiendo de las características específicas de los sistemas de afinidad elegidos, el esquema de elución apropiado pueda ser adoptado.
En general, la calidad de los resultados obtenidos se verá afectada de manera significativa por la calidad de la preparación de la muestra. Es importante trabajar con cuidado y precisión a través de cada paso de estos protocolos, y lo más rápidamente posible, manteniendo cuidado y precisión. Es aconsejable realizar un seguimiento de la partición de la proteína de interés a través de cada paso para entender la eficiencia de cada manipulación. Por ejemplo: ¿cómo abundante es la proteína de interés en la célula o tejido en cuestión? Tal vez la proteína en estudio (y sus complejos) será difícil de caracterizar en masaespectrometría debido a la baja abundancia. Si los complejos purificados son detectables mediante tinción de proteínas en general (aproximadamente nanogramos gama), espectrometría de masas es probable que tenga éxito. Si la proteína capturado de interés sólo se puede detectar mediante transferencia sensible mejorado quimioluminiscente Western (aproximadamente gama picogramos), espectrometría de masas es menos probable que sea eficaz. Incluso si la proteína de interés es abundante en la célula, cómo es abundante que en el extracto celular producida? ¿La partición de la proteína a la solución o se trata en el pellet? En este último caso, una nueva solución de extracción se puede diseñar que pueden mejorar la recuperación. Una vez que el extracto celular se combina con el medio de afinidad, la eficacia de capturar la proteína? ¿La proteína siguen vinculados a través de lavados posteriores? ¿Qué pasa con otras proteínas copurifying? Al guardar una alícuota de cada muestra en las etapas apropiadas del protocolo de estas preguntas pueden ser contestadas con facilidad, por lo general por el Western Blot contra la proteína de interéso tinción de proteínas en general, pero otros ensayos también pueden ser adecuados. La optimización de cada paso será mejorar el rendimiento y la pureza de los complejos capturados, aunque puede haber una compensación que se hizo en la maximización de un atributo o la otra.
Una aplicación típica de captura por afinidad para muchos investigadores es identificar candidato en interactores in vivo para un pequeño número de proteínas de interés; estos candidatos son sometidos comúnmente a la validación por enfoques ortogonales in vivo para demostrar la importancia biológica de los interactores físicas. Captura por afinidad también se emplea en los estudios de alto rendimiento para generar listas de copurifying proteínas observadas de forma (casi) todo el proteoma, facilitando inferencias relativas putativo computacionales complejos en vivo. Numerosos ejemplos de tales estudios se pueden encontrar en la literatura. Este enfoque renuncia a la optimización de las condiciones de captura para cualquier diana dada a favor de exploración del hombreobjetivos de Y; Como tales, los complejos inferidos mismos están rara vez recuperado completamente intacto y altamente pura en cualquier muestra dada. Más bien, las superposiciones parciales en composiciones observadas entre numerosas muestras de afinidad-capturado distintas se utilizan como base de las inferencias 42. Ambos enfoques aportan datos valiosos para nuestra comprensión de la interactoma. Sin embargo, una ventaja importante de captura por afinidad es que con frecuencia ofrecen la oportunidad de obtener los complejos intactos y altamente purificada, a condición de que se hagan esfuerzos para optimizar el procedimiento. Creemos que el futuro del enfoque radica en el aumento de la facilidad y eficacia de la optimización de la captura de complejos de proteínas endógenas 11, para una evaluación más precisa de la gama de interactores fisiológicas y un uso más frecuente en más bioquímica aguas abajo, enzymological, y estudios estructurales, por ejemplo, hace referencia a 7,9,23.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al profesor Brian T. Chait por su inestimable asesoramiento, apoyo y acceso a MS instrumentación, así como la Sra. R. Kelly Molloy por su excelente apoyo técnico. Agradecemos a la Sra Kelly descubierto por el apoyo con la edición. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH P41GM109824, P41GM103314, y P50GM107632.
Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
Extractant | For affinity capture (III) | ||
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
DTT | For affinity capture (III) | ||
SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
Protein Stain | For affinity capture (III) |