JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
português

Automatically Generated
Biochemistry

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Published: December 09, 2016
doi:
10.3791/54518
, ,
1Laboratory of Cellular and Structural Biology,The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,New York University School of Medicine

Summary

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Abstract

captura de afinidade é uma técnica eficaz para isolar complexos de proteínas endógenas para um estudo mais aprofundado. Quando usado em conjunto com um anticorpo, esta técnica é também frequentemente referida como imunoprecipitação. de captura por afinidade pode ser aplicado em uma escala de bancada e num contexto de alto rendimento. Quando acoplada a espectrometria de massa de proteína, captura de afinidade provou ser um burro de carga da análise interactome. Embora existam muitas maneiras potencialmente para executar os vários passos envolvidos, os seguintes protocolos de implementar os nossos métodos favorecidas. Duas características são distintos: o uso de pó de células cryomilled para produzir extractos celulares e esferas paramagnéticas acopladas a anticorpo como meio de afinidade. Em muitos casos, obtivemos resultados superiores aos obtidos com mais práticas convencionais de captura de afinidade. Cryomilling evita numerosos problemas associados com outras formas de rebentamento celular. Ele fornece quebra eficiente do material, evitando ao mesmo tempo denatURAÇÃO problemas associados com o aquecimento ou a formação de espuma. Ele retém a proteína nativa concentração até ao ponto de extracção, mitigando dissociação macromolecular. Reduz o tempo de proteínas extraídas passar em solução, limitando actividades enzimáticas deletérios, e pode reduzir a adsorção não específica de proteínas por meio de afinidade. Micron escala meios de afinidade magnética têm se tornado mais comum nos últimos anos, cada vez mais substituindo o agarose- tradicional e mídia baseada em Sepharose. principais benefícios de meios magnéticos incluem adsorção de proteínas não-específicas tipicamente inferior; nenhum limite de exclusão de tamanho, porque proteína de ligação ocorre na superfície do grânulo em vez de dentro dos poros; e facilidade de manipulação e manuseio usando ímãs.

Introduction

Uma aplicação típica dos procedimentos apresentados é para estabilizar e obter um elevado rendimento e grau de pureza de complexos de proteínas endógenas de interesse para a caracterização interactomic 1. Entende-se que as redes dinâmicas de ambos os complexos macromoleculares associadas estavelmente e transientemente, principalmente compostas por proteínas, orquestrar processos celulares 2,3. Embora existam muitas abordagens experimentais para a identificação de interações proteína-proteína, captura de afinidade é um dos métodos mais utilizados para isolar e dissecando complexos de proteínas fisiológicas 4-6. Além disso, esta técnica tem a vantagem de produzir os complexos macromoleculares como entidades físicas, não apenas como pontos de dados em uma leitura; De modo vantajoso, os complexos obtidos podem, portanto, ser utilizado num hospedeiro de bioquímica adicional a jusante, enzimáticos e ensaios estruturais 7-9. Os protocolos apresentados foram desenvolvidos em resposta à necessidade de mapear proteiredes de interação n-proteína e caracterizar complexos macromoleculares em seus papéis como as moléculas efetoras da biologia celular. Eles encontram-se detalhados no que diz respeito à sua aplicação a células de mamífero crescidas em cultura de tecidos, mas são igualmente aplicáveis ​​a uma grande variedade de amostras biológicas dadas ajustes específicos do sistema apropriadas.

A história da captura de afinidade remonta ao início do século XX, com as primeiras experiências de cromatografia de imunoafinidade – semelhante ao que é comumente referido hoje em dia como imunoprecipitação (IP) – que aparece na literatura por início dos anos 1950. Uso Mainstream da técnica desenvolvida por meio da virada deste século até o presente 10-13. Celular diversificada e estudos de biologia molecular têm utilizado a ruptura mecânica das células por moagem em temperaturas criogênicas, pelo menos nos últimos quarenta anos, 14-19; e separações moleculares utilizando (super) esferas paramagnéticas tem become cada vez mais comum ao longo das duas últimas décadas 20. A combinação destas diferentes tecnologias tem servido para melhorar sinergicamente os resultados que podem ser obtidos em experimentos de proteína complexo de captura de afinidade 1, como evidenciado por um extenso corpo de trabalho produzido por nós mesmos e da ampla comunidade científica 7,9,11,18,19,21 -23. Apoiando resultados são apresentados na Figura 1.

Uma colecção de advertências e considerações aplicáveis para executar as experiências de captura por afinidade eficazes pode ser encontrado na referência 1. Tipicamente esta abordagem é mais apropriado para: (I) catalogar os interagentes de uma proteína de interesse, ou seja, utilizar a espectrometria de massa de proteína (MS) para identificar proteínas copurifying até então desconhecidos (análise exploratória); (II) de ensaio para a presença de um parceiro interagindo particular, ou seja, utilizar MS ou Western blot para detectar uma proteína particular ou conjunto limitado de proteínas em que se suspeitainterajam com a proteína de interesse (testes de hipóteses); ou (III) preparar complexos de proteínas endogenamente montados contendo a proteína de interesse para um estudo mais aprofundado por técnicas adicionais (workup preparativa). Antes de iniciar o regime experimental de captura por afinidade que é absolutamente essencial para ter um reagente de afinidade de alta qualidade que se liga à proteína alvo, tipicamente, um anticorpo de IP-competente contra a proteína alvo nativo de interesse ou de encontro a uma etiqueta anexa para uma proteína de fusão. Também é crítico para ter métodos adequados de leitura experimental em lugar: coloração da proteína geral (tais como azul de Coomassie, Sypro Ruby, ou prata, após SDS-PAGE), transferência de Western, e a proteína MS são comumente utilizados em conjunto com captura de afinidade 1. Os protocolos apresentados utilizam esferas magnéticas conjugados de anticorpos, como meio de afinidade. Embora a função do meio de afinidade pode ser inicialmente validado em testes que utilizam alguns parâmetros experimentais, aobter os melhores resultados de cada ensaio, devem ser empiricamente otimizados 1,11,24. Os protocolos são separados em três fases distintas: (1) preparação do material celular congelada; (2) a ruptura de células por meio de moagem no estado sólido à temperatura criogénica; e (3) a extracção de proteína e de captura de afinidade utilizando esferas paramagnéticas acopladas a anticorpo.

Protocol

1. colheita de células e de congelação Cresça 1-8 g de material celular, utilizando as condições de cultura adequados para a linha celular de interesse 25,26. Este protocolo é otimizado para até 8 gramas de células (~ 10 9 células), modificados a partir de referências 19,27,28. Tipicamente, ~ 5 g de células HEK-293 ou HeLa pode ser obtido a partir de oito placas de 500 cm 2 de cultura cultivados para ~ 90% de confluência. ATENÇÃO: Estes protocolos utilizam nitrogênio líquido (LN 2), capaz de causar queimaduras criogênicas graves. vestuário de protecção Don e exercício adequado precauções de manuseamento. Deitar fora o meio de crescimento (resíduos) em um copo grande. Coloque a placa de cultura no gelo em uma panela grande de gelo retangular. Adicionar 20 ml de gelo-frio 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) para o prato de cultura e libertar as células a partir da placa utilizando um raspador de células grande; transferência das células para um tubo de 50 ml, pré-arrefecido em gelo; segure o tubo em gelo. NOTA: Para todas as células etapas de manuseamento usar um set electro-pipeta para "baixo" e 25 ml pipetas para evitar cisalhamento excessivo de células durante as manipulações de transferência. Organizar 50 ml tubos de coleta e 1x PBS em um balde de gelo antes de iniciar o procedimento. Adicionar mais 10 ml de gelo-frio 1x PBS para o mesmo prato. Recolher as células restantes e transferi-los para o tubo de 50 ml. Repita o procedimento para cada prato; suspensões de células de diferentes pratos podem ser combinados para reduzir o número de amostras e resíduos de plástico. Observação: Uma vez que as próprias células não irá constituir uma grande proporção do volume de suspensão, três placas de valor de suspensão de células podem ser combinados em dois tubos de 50 ml. Porque tubos de 50 ml realmente manter mais do que o volume nominal, oito placas podem normalmente ser distribuídos em cinco desses tubos. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg, 4 ° C. Cuidadosamente deitar fora o sobrenadante. Ressuspender cada pellet em 10 ml gelada 1x PBS. Consolidar o resupelotas spended, até 5 por tubo de 50 ml, para reduzir o número de amostra. Centrifugar 5 min a 1000 xg, 4 ° C. Cuidadosamente deitar fora o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 10 ml de gelo-frio 1x PBS Remova o êmbolo de uma seringa de 20 ml e reserve. Tapar o bocal da seringa e transferir a suspensão de células a ela. Colocar a seringa dentro de um tubo de 50 mL e centrifugar 5 min a 1000 xg, 4 ° C. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de ponta fina ligada a um sistema de sifão de vácuo até que apenas a camada superficial de células começa a ser aspirada. Isto resulta num sedimento celular húmido. Destape a seringa, insira o êmbolo e escorrer as células diretamente em um grande copo de plástico cheio de LN 2, realizado em um banho de LN 2 em uma caixa de isopor. Forçosamente mergulhar as restantes células a partir da seringa. Transferir as células congeladas para tubos de 50 ml por meio de vazamento. Genericamente tampar os tubos para permitir que o excesso LN 2 para evaporar; segure tdurante a noite bainha a -80 ° C. Apertar as tampas totalmente no dia seguinte. A célula congelada pode ser armazenada nesta forma à temperatura de -80 ° C até cryomilling. NOTA: Não firmemente fechar os tubos antes de todo o LN 2 visivelmente evaporou-se, caso contrário, a pressão excessiva pode fazer com que o tubo para explodir. Não fechar os tubos após o LN 2 se dissipe pode resultar na acumulação de gelo sobre o material de células, a adição de excesso de peso da água e reduzindo eficazmente a concentração de proteínas mediante moagem. 2. A interrupção criogênica de células congeladas NOTA: Todas as ferramentas para fresagem e manipulações devem ser pré-arrefecidos com LN 2. Uma pequena garrafa irá ser necessário para a adição de LN 2, dentro do frasco e para o vazamento LN 2 através da parte superior do frasco fechado de moagem. Uma ferramenta caseiro é mostrado na referência 19. Luvas criogênicas serão necessários para lidar com a LN 2 refrigerado aparelho de moagem. a moagemtampas de potes usados aqui (ver Tabela de Materiais) normalmente fornecido com uma junta de borracha instalado; este terá de ser substituído com uma tampa de Teflon junta comercialmente disponível para executar de forma fiável o protocolo seguinte. Além disso, porque a pressão de N gasoso 2 pode construir até níveis altos dentro do frasco durante a moagem, recomendamos a instalação de um / 500 válvula de pressão comercialmente disponível 5 bar kPa como uma precaução de liberação de segurança 28. Remover os grânulos de células de armazenamento de -80 ° C e manter num suporte de tubos de 50 ml num banho de LN 2. Pré-arrefecer o frasco de 50 ml, duas bolas 20 mm, e tampa em um balde de gelo rectangular limpo contendo LN 2. Pré-resfriar o isolador (PTFE) Polytetrafluoroethylene se estiver usando um; quer um conjunto de discos (ver referência 27), ou uma manga-e-disco (veja a Figura 2). Pré-resfriamento é concluído quando a ebulição violenta de LN 2 acalma. Definir contrapeso adequado nomoinho. NOTA: Este será igual à massa do frasco, a tampa do frasco, as esferas de moagem a ser utilizado, e a quantidade de células a serem adicionados ao frasco. Se forem utilizados os isoladores de PTFE, a sua massa deverá também ser incluído. Sugerimos a gravar as massas do frasco, tampa e bolas (e sua massa combinada, incluindo qualquer isolante utilizado) com antecedência e gravá-las em uma folha informativa armazenados perto do moinho. Utilizando uma pinça, coloque os dois 20 bolas mm moagem pré-refrigerado e as células congeladas dentro do frasco de moagem pré-arrefecido. Nota: Devido a pequenas perdas de material nas superfícies do frasco e bola durante a moagem, a percentagem de aumentos materiais recuperados como a massa de células aumenta moída. Pelo método descrito, as perdas de material são muito modestos, sendo da ordem de ~ 0,3 g de peso molhado de células (WCW). as orientações do fabricante indicam o volume máximo de amostra carregada deve ser ~ 1/3 do volume de frasco. 29 O volume total das esferas devem ser ~ 1/3 e Remaining ~ 1/3 espaço livre é para a livre circulação das bolas. Adicionar LN 2 para o frasco até ~ ½ cheio, colocar a tampa no frasco e transferir a montagem para a fábrica. NOTA: Primeiro instale o isolador escolhido se usar um. Fixe a montagem no local e executar três ciclos de moagem usando seguinte programa: 400 rpm, 3 min, a rotação reversa cada minuto, sem intervalo intervalo. Arrefecer o frasco de fresagem com LN 2 entre cada ciclo. NOTA: Durante a moagem um ruído clunking distinta é gerado como as bolas colidem dentro do frasco em movimento planetário. Se estes sons não são ouvidos, moagem não está ocorrendo. Terminar o ciclo de moagem, não contam este ciclo, mova o conjunto do frasco de volta para LN 2 e examinar o conteúdo do frasco. Garantir que não há formação de gelo e se ele tem, Chip-lo longe das paredes do frasco com uma espátula de pré-arrefecido. Começar de novo a partir do passo 2.5. Se não usando nenhum isolador ou isolante discos, mover o conjunto frasco de volta para LN <sub> 2 entre ciclos de re-frio e adicione LN 2 a ~ ½ completo de cada vez. O LN 2 adicionado irá evaporar dentro do frasco quando a temperatura do frasco aumenta durante a moagem. Isso resulta em aumento de pressão dentro do frasco. Portanto, quando desengatar o frasco da fábrica, solte o grampo de forma muito lenta. Se o grampo é liberado rapidamente, pó de célula pode escapar com despressurização rápida. Uma libertação lenta do grampo permite que a pressão escape do frasco de uma maneira suave e controlada, e evita a perda de material celular. A fuga suave de N gasoso 2 pode muitas vezes ser ouvido assobios como o grampo é liberada lentamente – isso é normal. Se estiver usando um isolante manga-and-disco, o conjunto do frasco pode ser deixado no moinho e LN 2 adicionada à montagem isolante / jar in situ. Mova o frasco de volta para LN 2, e deixe descansar por um momento para esfriar. Se utilizar uma manga isolante-e-disco, o frasco pode ser removido da manga Wom a ajuda de duas espátulas, que permite uma alavancagem de cada lado. Uma vez que o frasco está descansando em LN 2, retire cuidadosamente a tampa, remover as bolas usando uma pinça, e transferir o pó a um tubo pré-arrefecidos 50 ml usando uma espátula de pré-arrefecido. Adicionando um pouco de LN 2 ao frasco aberto / pó pode ajudar a desalojar pó que é endurecido para as bolas, antes de removê-los. NOTA: Uma vez que o frasco foi aberto, adicionar uma pequena quantidade de LN 2 a ela antes de remover as bolas. Isso vai ajudar a recuperar pó endurecido nas superfícies. pó celular deve ser realizada à temperatura de -80 ° C ou abaixo até à sua utilização. Na nossa experiência, pó de células pode ser armazenada nesta forma, essencialmente indefinidamente, sem afectar o desempenho. 3. Affinity captura de complexos de proteínas a partir de extractos celulares NOTA: O protocolo seguinte implementa meios de afinidade composta de um ligando de afinidade, isca, ou o anticorpo que interage com a proteína de interesse, co-upled para micro-escala esferas paramagnéticas. Estes podem ser preparados em casa 19,30, usando kits disponíveis comercialmente, ou adquiridos como reagentes prontos. Preparação de extracto celular NOTA: Ao manusear pó de pilha, lembre-se de usar utensílios e tubos pré-arrefecidos com LN 2. Os tubos contendo o pó de células deve ser sempre realizada em LN 2, quando não a -80 ° C. Colocar o tubo (s) de 50 ml contendo células de pó num suporte de tubos, em um recipiente de isopor com LN 2. Pesar 100 mg de pó de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml ou 2. NOTA: Temos observado que esta quantidade de células é um bom ponto de partida que normalmente produzem a proteína alvo de dezenas a centenas de nanogramas variam após a captura de afinidade para uma proteína moderadamente expressos (~ 50 massa kDa, presente em milhares de cópias por celular), presumindo-se a extração e capturar eficiências de o alvo são ≳70%. Tais rendimentos prever visualiz diretação da fracção purificada por SDS-PAGE e coloração da proteína. balança analítica de tara com o tubo de microcentrífuga vazio. Dispensar pó de células para um tubo utilizando uma LN 2 arrefecida colher ou espátula. Verifique a massa do pó no interior do tubo dispensado na balança analítica. NOTA: Para facilitar a pesagem de pós celulares, podem ser utilizadas pequenas colheres de medição volumétrica. Estes foram encontrados para se obter resultados reprodutíveis (ver referência 19). Nós encontramos melhores resultados usando tampa de rosca ou 'safe-lock' microtubos. A pressão de evaporação LN 2 que podem introduzir os tubos podem causar tubos de microcentrífuga padrão para se abrirem durante o aquecimento subsequente apenas antes da adição da solução de extracção – potencialmente resultando em perda da amostra. Abrir o tubo (ou afrouxar o parafuso-tampão) com pó de célula e deixe repousar à temperatura ambiente durante 1 min. Isto irá libertar a pressão no interior do tubo e impedir o congelamento imediato da extracçãosolução, quando adicionados ao pó. Nenhuma descongelamento é observada durante este 1 min de incubação. Adicionar 400 ul de extracção suplementado com inibidores da protease e vortex brevemente, em seguida, mantenha em gelo enquanto prosseguir para a etapa 3.1.5. As amostras devem ser mantidas em gelo entre todas as manipulações subsequentes até eluição. NOTA: A melhor composição do agente de extracção vai depender do complexo de proteína (s) a ser purificada. Alguma orientação geral é fornecida na Tabela 1 e as referências de apoio. Use um ultrasonicator MICROTIP para dar o exemplo de um breve impulso de baixa energia para dispersar quaisquer agregados. (Ultra) sonicate com 4 pulsos (2 segundos cada, 2 A; aproximadamente 15-20 J da energia total). NOTA: vórtex dispensa do pó para a célula de extracção, mas, dependendo do carácter solução, podem ser observados alguns agregados. Descobrimos que dispersar estes agregados prevê o melhor rendimento durante a captura de afinidade subsequente. Uma breve MICROTIP sonicatiónica dispersa-se facilmente esses agregados. A solução deve aparecer semi-translúcido, mas homogénea, sem agregados óbvias. sonicators banho de água tendem a ser demasiado baixo consumo de energia para dispersar de forma eficiente tais agregados sem tempos de manipulação de amostras significativamente mais longos, mas podem ser adequados, com configurações adequadas. Clarificar o extracto por centrifugação (por exemplo, 20.000 xg, 10 min, 4 ° C). NOTA: se uma alíquota do extracto celular clarificado pode ser guardado para comparação com o conteúdo do sedimento, o sobrenadante de captura de afinidade, e as fracções obtidas após eluição a partir do meio de afinidade para determinar a eficiência de extracção e de captura da proteína alvo , por exemplo, por western blot (ver discussão). Remover o sobrenadante (extracto clarificado) e proceder à captura de afinidade. NOTA: O pelete pode ser reextraída em SDS-PAGE tampão de carregamento de amostras, a 70 ° C para determinar o grau de libertação da proteína alvo durante a extracção inicial não desnaturante por comparação com o extracto obtido no passo 3.1.6. Captura de afinidade Pré-lavagem do meio de afinidade magnético. Isto pode ser feito enquanto extractos celulares são centrifugados. Colocar o tubo (s) sobre o ímã. Os grânulos irão acumular-se no lado do tubo dentro de segundos, permitindo que a solução de armazenamento a ser removido. Adicionar 500 ul da solução de extracção para os grânulos. Resumidamente mix vortex a velocidade média (suficiente para voltar a suspender). Pulse-girar os tubos em um mini-centrífuga para recolher todo o conteúdo para o fundo. Isso garante a transição mínimo de soluções. Coloque tubos no ímã e aspirar a solução. NOTA: A mídia magnéticos com características distintivas estão disponíveis a partir de uma ampla variedade de fornecedores comerciais. Os resultados podem variar dependendo estas características, incluindo o tamanho do grânulo, uniformidade, revestimento de superfície, e a química de acoplamento de anticorpo. Side-by-side ensaios em sua aplicação são recomendadas antes de escolher um reagente de escolha. Iniciar a captura de afinidade, transferindo o extracto de células clarificado para um tubo de 1,5-2,0 ml contendo meio de afinidade pré-lavada e vortex brevemente para voltar a suspender. Incubar durante 30 min a 4 ° C com agitação suave contínua sobre uma roda de rotor; as contas deverão permanecer suspensas durante toda a incubação. Pulso-girar os tubos num mini-centrifugador para recolher todo o conteúdo para o fundo do tubo. Aspirar o sobrenadante e lava-se as pérolas três vezes com 1 ml de solução de extracção a frio tal como descrito no passo 3.2.3. Colocar os tubos no ímã. Remover a solução. Continuar a adicionar a solução seguinte e repetir. Durante a lavagem 2º, transferir as contas e solução de lavagem em conjunto para um tubo de microcentrífuga fresco por pipetagem. Isto reduz a contaminação da amostra, no ponto de eluição, por proteínas adsorvidas aleatórias para as paredes do tubo utilizado para a incubação com tele celulares extrato. Após a lavagem 3º, as contas devem ser brevemente fiado pulso em um mini-centrífuga para recolher todo o conteúdo para o fundo. Coloque o tubo de volta no ímã, e remover qualquer líquido residual. Isto permite a remoção dos últimos ul de solução antes da eluição, assegurando as amostras eluídas terá volumes uniformes. Também assegura a eluição será eficaz, como a solução de eluição não será diluído por lavagem residual; estes resíduos também podem contribuir para os efeitos de sais e alterar a migração de proteínas em SDS-PAGE (ver abaixo). NOTA: se uma aliquota do sobrenadante pós-ligação pode ser guardado para comparação com o extracto clarificado gerado em 3.1.6. por western blot. O resultado irá indicar o grau de degradação da proteína alvo a partir do extracto celular. Elui-se em qualquer forma nativa ou desnaturante; considerar a melhor estratégia para a aplicação a jusante 1. NOTA: Os detalhes de strategie eluição nativas dependerá do marcador de afinidade utilizado (ver discussão). Para a maioria dos utilizadores, desnaturantes de eluição com tampão de amostra de SDS-PAGE seguido por análise da amostra por SDS-PAGE com coloração de proteína de 31, vai ser a primeira abordagem mais prática. NOTA: A composição do tampão de amostra irá depender do sistema de electroforese a ser utilizado. Muitos laboratórios lançaram suas próprias géis de Tris-glicina, fazendo uso de electroforese em descontínuo e o sistema tampão de Laemmli 32-34. Uma receita de tampão de amostra comum (1x) inclui: 10% (w / v) de sacarose, 50 mM de DTT, 2% (w / v) de SDS, 62,5 Tris-Cl mM, pH 8,8, 0,0004% (w / v) de azul de bromofenol 31 . Sugerimos a preparar um estoque de 1,1x que omite DTT. 1/10 do volume de DTT 500 mM devem ser adicionados à amostra antes de SDS-PAGE (ver abaixo). Muitos sistemas de SDS-PAGE comercialmente disponíveis também estão disponíveis; estes podem incluir tampões de amostras específicas do sistema. Adicionar tampão de amostra SDS-PAGE sem agente redutor (para mitigar a liberaçãode cadeias de anticorpo a partir dos grânulos) e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente com agitação. NOTA: Este irá interferir com a maioria das interacções baseadas em afinidade, libertando as proteínas capturadas para o sobrenadante. interacções mais persistentes podem beneficiar de temperatura elevada para a libertação (tipicamente 70 ° C é suficiente). Recolher e guardar o sobrenadante. As amostras podem ser congeladas a -20 ° C durante breve armazenamento (alguns dias) ou -80 ° C para armazenamento prolongado até que a análise é desejada. Submeter as amostras a SDS-PAGE seguida por coloração da proteína, utilizando técnicas padrão 31. MS pode ser utilizada para caracterizar a composição da amostra 1. bandas de proteína individuais podem ser excisada para a identificação ou a totalidade da amostra pode ser caracterizado por um único análise por electroforese da amostra apenas brevemente (4-6 mm no gel) e o processamento de todas as proteínas na amostra em conjunto como uma "camada de gel. ' NOTA: Adicionar DTT antes Initiaeletroforese ting. Se o planejamento para prosseguir para MS, as amostras podem ser alquilada após eletroforese 35; No entanto, é frequentemente mais conveniente para alquilar 36 antes da electroforese.

Representative Results

Figura 1, painel I ilustra que cryomilling e esferas magnéticas podem trabalhar juntos para melhorar a qualidade da amostra. Painéis IA-C mostram que o material que compreende a forma insolúvel utilizado para a captura por afinidade pode afectar o proteoma recuperado 19. A proteína de interesse, a fosfatase alcalina bacteriana marcado com FLAG purificada (BAP), foi enriquecida em extractos de células humanas. BAP não é esperado para interagir especificamente com copurify e proteínas humanas. A assinatura de proteínas copurifying, avaliado por SDS-PAGE e coloração com Coomassie, variar dependendo do meio usado. Micron escala pérolas magnéticas mostraram o perfil mais limpo, o que indica um nível relativamente baixo de adsorção de proteína não-específica. Painéis ID e IE ilustram que o método de lise de células pode também afectar o proteoma recuperado. No exemplo dado, um complexo de proteína endógena (o próximo complexo 37), foi submetido a captu afinidadere a partir de células cyromilled ou sonicado extrai 19. foram observados menos elevados contaminantes em massa quando o extrato celular foi produzido a partir de pó de células cryomilled. Um desafio quando se utiliza de captura por afinidade para estudar os complexos de proteína endógena é que pode ser difícil discriminar interactores fisiológicas bona fide da proteína de interesse a partir de falsos positivos (FPS). PQ pode surgir a partir de muitas fontes, incluindo adsorção não-específica para tubos e vasos, o meio de afinidade, o anticorpo ou o ligando de afinidade, e / ou para a proteína de interesse em si. Como resultado, um esforço significativo tem de ser dedicado a optimizar o processo de captura. A detecção dos PQ continua a ser um desafio central para o qual um grande número de diferentes ferramentas foram desenvolvidas, incluindo experimental 38-40 e computacional se aproxima de 41-43, cada um com diferentes vantagens e desvantagens. Em nossas próprias experiências que anteriormente observado um padrão de FA ligação de proteína P, obtido após a incubação de α-FLAG suporte magnético com extractos de células de controlo, que era distinto do padrão obtido na presença de proteínas 3xFLAG-tag. Além disso, estes PQ pode ser libertado a partir do meio de incubação com o péptido 3xFLAG 7. Esta observação é consistente com a ligação oportunista de PQ para o paratopo α-FLAG na ausência do epítopo cognato. Compreender a natureza deste fundo FP é importante, pois muitos estudos utilizam uma "linha de células parental» não marcado como um controlo simulado para captura de afinidade; estes controlos podem, portanto, ser inadequada para determinar a especificidade da interacção com a proteína etiquetada. Para determinar a ligação de fundo contribuiu por nosso meio de afinidade quando paratopos anticorpos são ocupados ou não, realizamos simulações de experimentos de captura de afinidade usando α-FLAG extratos de células HEK 293T (nenhuma proteína marcada expressa) na presença meio magnético e ou ausência de um 3xFLAGpéptido-pico em. Os resultados são mostrados na Figura 1, o painel II. Resumidamente, α-FLAG suporte magnético foi incubada em extractos de células (de ≳10 mg / ml de proteína total) contendo NaCl 500 mM e 1% v / v de Triton X-100 em 20 mM HEPES-Na, pH 7,4 durante 30 min. O meio foi, em seguida, incubadas com 1 mg ml de péptido / 3xFLAG para deslocar competitivamente quaisquer proteínas ligadas ao paratopo α-FLAG nativamente ou com tampão de amostra de SDS-PAGE para alcançar uma eluição de desnaturação. Além disso, a mesma experiência foi realizada quando os extractos de células foram misturados com 1 ug / ml e 10 ug / ml de péptido 3xFLAG. Todas as fracções eluídas foram sujeitas a SDS-PAGE e coloração com prata. Observou-se que, na ausência do seu epitopo cognato, forma α-FLAG capta um nível detectável de proteínas de fundo que podem ser diluídos com péptido 3xFLAG – no exemplo apresentado na Figura 1-II, uma espécie dominante foi observada a entre 37 e 50 kDa. O padrão eluída comtampão de amostra SDS-PAGE foi comparável, com espécies proeminentes adicionais. No entanto, na presença de péptido / ml 3xFLAG 1 ug, FP de ligação ao meio de afinidade foi eliminado para abaixo do nível de detecção e não foi observado em qualquer das fracções de eluição nativas ou desnaturantes. Este resultado sugere que paratopos de anticorpo não ocupados pode ser promíscuo na ausência do seu epitopo cognato e contribuem significativamente para o proteoma obtido durante a captura de afinidade mesmo para anticorpos que se ligam a epitopos de elevada afinidade, como é o caso para o 3xFLAG / α-FLAG M2 emparelhamento. Também suggestd que utilizando condições muito rigorosas de sal elevada, muitas vezes escolhida para minimizar a ligação não específica, pode ser ineficaz na ausência da interacção antigénio / anticorpo. Para o acompanhamento foi realizado um experimento incluindo análise semelhante por SDS-PAGE, bem como quantitativa MS (Fig. S1). Das 347 proteínas quantificadas, observou-se que todas as proteínas com exceção de uma (falsa discomuito taxa = 1%; Tabela S1) foi associada com a proteína isco 3xFLAG-etiquetada, em comparação com um péptido 3xFLAG cravado amostra de controlo. Estes resultados indicam que nas nossas experiências a grande maioria das proteínas observadas são susceptíveis de co-purificar com a protea etiquetada ou fora do alvo são subprodutos de paratopos α-FLAG desocupados. Na nossa experiência, resultados mais elevados de captura por afinidade de sinal-para-ruído são exemplificados em SDS-PAGE e coloração da proteína por um padrão distinto de bandas nítidas, abundantes e aproximadamente estequiométricas, bem como uma escassez de coloração de fundo a partir de outras bandas mais fracas; numerosos exemplo deste princípio pode ser visto em referência 11. O motivo para a utilização de um isolador PTFE (que é recomendado) quando cryomilling é o de reduzir a taxa de aquecimento do frasco durante a moagem, mitigar a carga de arrefecimento repetido LN 2 durante o processo de moagem e reduzir o grau de geloformação na jarra. Isto facilita o desempenho de moagem consistente e facilita a manipulação do pó célula. Exemplo isoladores podem ser encontrados na referência 27 (discos) e representado na Figura 2, abaixo (manga-e-disco). Figura 1: Selecione Resultados representativos. (I) Este painel foi modificado a partir de referência 19. Azul de Coomassie corados em gel de SDS-poliacrilamida. (À esquerda) Micron escala magnética contas de mostrar menor off-meta vinculativa do que os meios de agarose-base. (A) esferas magnéticas; (B) de agarose tradicional; (C) de ferro impregnado (magnética) agarose; cada um acoplado a anticorpos anti-Flag M2 e usado para capturar fosfatase alcalina bacteriana FLAG-tag (BAP; rotulados) cravado em extractos produzidos a partir de células HEK-293 cryomilled. purificações à base de agaroseapresentaram maiores níveis de adsorção não específica (faixas sem rótulo). (direita) Os extractos produzidos a partir de células HeLa cryomilled exibem menor adsorção fora do alvo sobre esferas magnéticas acopladas a anticorpo do que as produzidas por ultra-sons, quando utilizado para purificar um complexo de proteína endógena. LAP-44 etiquetada RBM7 foi capturado por afinidade utilizando esferas magnéticas acopladas a anticorpos anti-GFP policlonais para purificar o complexo PRÓXIMO 19,37 (D) extracto produzido a partir de pó cryomilled; (E) produzido por sonicação extractos de células intactas. A barra preta vertical destaca uma região do gel onde as altas interactores não-específicos de massa são observados para ser enriquecido na amostra preparada por sonicação. As setas pretas indicam os interagentes específicos esperados (marcado). Bandas observadas ~ 50 kDa nas pistas D e E são atribuíveis a lama IgG cadeias pesadas. (II) corado com prata de SDS-gel de poliacrilamida. (Std.) A captura de afinidade simulada realizada em HEK-293extrai células T na forma padrão. Após a captura, a eluição do material ligado foi alcançada através de (N) não desnaturante de eluição com 1 mg / ml de péptido 3xFLAG ou (D) desnaturante de eluição em tampão de amostra de SDS-PAGE; (PB 1) como Std. mas o péptido 3xFLAG foi incluído na solução de extracção em 1 ug / ml para bloquear os paratopos α-FLAG no meio de afinidade; (PB 10) de PB 1, mas na presença de péptido / ml 3xFLAG 10 ug. bandas relacionadas-IgG e péptido 3xFLAG são rotulados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Manga-and-puck PTFE isolante. Um frasco de 250 ml de PTFE é mostrado (1). Um frasco de 50 ml de moagem aço inoxidável (2) se encaixa no interior do frasco de PTFE (3) e fornece ooportunidade para deixar o frasco de moagem instalado dentro do moinho de entre os ciclos. Um disco de PTFE isolador superior (2) é usado entre o conjunto de braçadeira e a tampa do frasco. Para arrefecer o frasco e isolador de montagem instalada (3), LN 2 Adiciona-se directamente para dentro do corpo do isolador, em torno do frasco. O próximo ciclo de moagem pode, então, ser iniciada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Reagente Concentração sugerida notas O cloreto de sódio 0,1-0,5 M Altas concentrações (> 300 mm) tendem a melhorar a extração de proteínas totais e manter o fundo baixo, mas pode descascar afastado alguns entre outra forma estávelatores. As concentrações abaixo de 150 mM, tipicamente não são eficazes na redução de fundo não específico. O acetato de amónio 0,2-2 M Um sal, que consiste em dois buffers, que produz uma solução de pH neutro 57. Concentrações mais elevadas estabilizar alguns complexos de proteínas. soluções ácidas pode resultar de stocks cristalinas antigas, indevidamente armazenados em conta as perdas de amoníaco. Nenhum tampão de pH ou sais adicionais são necessárias no extractantes contendo acetato de amónio. Podem ser combinados com NaCl para modular os resultados obtidos. Tween 20 0,1% v / v Um detergente não iónico 58; tipicamente combinados com NaCl. Triton X-100 0,5-1% v / v Um detergente não iónico 58; tipicamente combinado com qualquer um de NaCl ou NH 4 CH 3 CO 2 H CHAPS 5 mM Um detergente zwitteriónico 58 </ Sup>; tipicamente combinados com NaCl. sarcosil 1 mM Um detergente aniónico 58 que reduz plano e pode retirar componentes complexos estáveis, potencialmente revelando conectividade binário; tipicamente combinados com NaCl. Tris-Cl 20 mM pK a de 8,8 a 4 ° C, 8,1 a 25 ° C. (PH 8,0) HEPES-Na 20 mM pK a de 7,8 a 4 ° C, 7,5 a 25 ° C. NaOH ou KOH utilizados por razões de equilíbrio de pH, dependendo o seu sal (por exemplo, NaCl, KCl, ou CH 3 CO 2 K) utilizado no extractante. (PH 7,4) Tabela 1: Uma sugerido alguns reagentes úteis para a purificação de complexos de proteínas. Esta tabela listas alguns reagentes que temos encontrado útil para complexos de proteína de purificação de linhas de células humanas, com concentrações de trabalho sugeridas. Uma formulação típica extractante contém um tampão de pH, um seu sal, e um detergente 1,11,24,45-48. A melhor prática é identificar a combinação menos complexo de reagentes que produz o resultado desejado. Figura S1: Misture Após análise Purificação (MAP) SILAC de falsos positivos. I. Diagrama esquemático: Nesta experiência marcaram-3xFLAG complexos proteicos ORF2p (expressas a partir pLD401) foram purificadas a partir de células HEK-293T pesada e leves marcado 7, respectivamente. A luz rotulada extrato celular foi enriquecida com peptídeo 3xFLAG para evitar captura de afinidade do ORF2p 3xFLAG-marcadas por inibição competitiva; este não é o esperado para bloquear a ligação de proteínas que podem ocorrer não-especicamente com o meio magnético ou as estruturas não-paratópicas do anticorpo. Após eluição a partir das esferas magnéticas, as amostras pesadas e leves foram misturados pós-purificação e analisadas por MS quantitativa (MAP-SILAC 39) para determinar a fracção de proteínas associadas com ambas as amostras; metodológica mais pormenor localizado na Tabela S1. II. Corado com prata de gel que ilustra que os materiais leves e pesadas marcado produzir resultados comparáveis ​​(comparar com G H), e que a purificação conduzida na presença de a-pico 3xFLAG (LI) foi competitivamente inibida. A seguir, uma L-250 tampão de gel manchado com Azul de Coomassie consistindo do H e misturado fracções Li, antes da análise proteómica à base de gel, como descrito na Tabela S1. Por favor clique aqui para baixar uma versão maior desta figura. Tabela S1:MAP-SILAC. Esta folha contém os dados obtidos após a execução do experimento MAP-SILAC descrito na Figura S1. Por favor clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Estes três protocolos funcionam em tandem para (1) preparar as células para ruptura de estado sólido por cryomilling, (2) atingir a ruptura num moinho de bolas planetário, e (3) produzir extractos a partir de pó de células por afinidade de captura de uma proteína de interesse num complexo com seus interagentes fisiológicos. Existem muitas técnicas de lise celular diferentes, incluindo abordagens mecânicos / físicos que empregam esmagamento impacto, corte, e / ou pressão, bem como / abordagens químicas enzimáticas, cada um com diferentes prós e contras 49,50. Cada pesquisador é encorajado a explorar métodos mais adequados para as referidas análises, tendo em mente que é susceptível de introduzir enviesamentos 51,52 necessitando de otimização empírica (discutido abaixo) qualquer abordagem escolhida para a ruptura celular e extração de proteínas. Os métodos mecânicos podem produzir calor elevado e / ou forças de cisalhamento que pode atrapalhar complexos de proteínas. Cryomilling evita efeitos de aquecimento em virtude da contratação de LN 2 de resfriamento de amostras para tele duração do processo. Moinhos de bolas planetários são entendidos como confiar em forças de impacto e atrito, incluindo a tensão de cisalhamento, como componentes de redução de tamanho de partícula 53,54. Nas configurações relataram que não observaram degeneração de complexos de proteínas. Na verdade, temos extraído e recuperado aparentemente intactas ~ 50 MDA complexos poro nuclear 11 e enzimaticamente retrotransposons ativos que exibem actividade específica mais elevada do que as preparações que empregam lise à base de detergente 'gentil' 7. Químicas / métodos enzimáticos de lise celular sofrem da limitação de que o conteúdo da célula é libertado para um in vitro meio que suporta a ruptura das membranas celulares e macromoléculas estruturais, mas pode não ser adequado para a manutenção da integridade do complexo de proteína (ES ) de interesse. Frequentemente, nem os componentes dos complexos formados com a proteína de interesse, nem as condições necessárias para estabilizar os complexos são alvoconhecida com antecedência. Um dos principais benefícios da moagem de estado sólido é que a ruptura e extração são desacoplado, permitindo fonte de material a ser preparado isento de líquido adicionado, armazenado (a -80 ° C ou abaixo), acumulou, e convenientemente recuperadas para a experimentação sob demanda; por exemplo, para explorar otimizado em condições in vitro para a captura de afinidade. Interacções de proteína são mais estáveis a alta concentração 55,56, minimizando assim o volume de agente de extracção pode ser vantajoso para preservar interacções fisiológicas. Por outro lado, existem considerações práticas – os complexos de proteína precisam de ser partilhada para fora das células e para uma fase aquosa não-viscoso, livre de agregados insolúveis, a fim de se misturar os complexos de destino com o meio de afinidade. Além disso, alguns padronização e controle sobre o ambiente in vitro (pH, concentração de sal, etc.) é necessário para sistematizar e reprodutibilidade. Nós achamos que extrai produced na faixa diluição de 1: 4-1: 9 (w: v) satisfazer as preocupações práticas e teóricas, produzindo resultados de qualidade. Além disso, a proporção óptima de extracto celular de afinidade necessidades médias de ser determinado. Isto é feito empiricamente por titulao de extractos com quantidades variáveis ​​de meio de afinidade e podem ter efeitos detectáveis ​​sobre a relação sinal-ruído do experimento, adicionalmente discutidas abaixo. Um excelente esgotamento da proteína alvo é tipicamente ≥70% da fracção solúvel da proteína alvo, mas> 90% é desejável e pode ser obtida com a parametrização cuidadoso das condições de extracção. Muitas dessas considerações práticas são cobertos em referência 1. contas paramagnéticas são manipulados usando ímãs de neodímio em um suporte de tubo de microcentrífuga especializado, embora alternativas caseiras são viáveis. Quando colocado dentro do suporte, grânulos se acumulem na parte lateral do tubo sob a influência do campo magnético. As soluções podem, então, ser removido sem disturbing os grânulos.

Uma limitação do protocolo apresentado cryomilling, desenvolvido com o moinho de bolas planetário aqui utilizado (Ver tabela de materiais), é que é necessária uma quantidade mínima de material para eficazmente moinho e recuperar pó celular utilizando este dispositivo (> 1 g). Tais quantidades são facilmente obtidas com muitos micróbios, linhas celulares, e organismos modelo, e pode também frequentemente ser alcançada com os tecidos excisados ​​de animais de laboratório. No entanto, certas linhas celulares pode ser muito difícil de crescer em tecidos de animais e abundância pode ser escasso. Pequenas quantidades de material pode ser comparativamente branqueado através de outros dispositivos que utilizam recipientes menores, embora, potencialmente, com o sacrifício da finura pó alcançado. Além disso, o custo dos dispositivos de moagem mecânica podem ser proibitivamente caros para alguns laboratórios. Cryomilling pode ser conseguida utilizando uma série de configurações alternativas 14-19, inclusive, mais acessível à mão usando uma pragale e argamassa, embora a eficiência quebra cai consideravelmente. protocolos de captura por afinidade tipicamente apontar para uma elevada eficiência da lise celular para facilitar a extracção máxima da proteína em solução e, portanto, o potencial máximo para a captura dos complexos de proteína alvo. Por outro lado, foi demonstrado por levedura no splicing in vitro extrai que a lise máxima pode não condiz com o máximo da actividade bioquímica vitro 57,58. Não observamos tais problemas nos sistemas que testamos até agora, e, portanto, não propositadamente limitar nossa ruptura celular quando cryomilling. No entanto, esta possibilidade deve ser tida em conta quando otimização para ensaios enzimáticos in vitro. Embora cryomilling é um método altamente eficaz para romper as células, uma quantidade limitada de sonicação frequentemente beneficia os extractos de células inteiras de produção de tecidos de mamíferos homogéneos porque não homogéneos agregados pode por vezes ser observada por inspecção visual: tipicamenteem condições de extracção usando baixo teor de sal (100-300 mM) e detergente não iónico (0,1-1% v / v) para concentrações moderadas. Uma vez que observou-se que a presença destes agregados pode reduzir o rendimento e / ou qualidade da captura de afinidade subsequente, que rotineiramente aplicar ultra-sons para dispersá-los (mesmo quando não são observados a olho nu). Os agregados são consistentes com fragmentos de membrana aglomerados, comparáveis aos anteriormente relatados em extratos de células de levedura moídos 58. A sonicação é também utilizado em alguns protocolos a cisalhamento de ADN e libertar fragmentos de cromatina em solução, no entanto, o grau de ultra-sons aplicada neste protocolo não apreciavelmente fragmento de ADN. A disponibilidade limitada (ou o elevado custo) de um ligando de afinidade excelente ou anticorpo contra a proteína específica de interesse pode ser um outro obstáculo. Uma ampla gama de reagentes de afinidade disponíveis comercialmente podem ser aproveitadas quando o organismo modelo é passível de marcação genómica ou transfection com vectores de expressão ectópica, que permitem a expressão das proteínas de interesse na forma de fusões marcado com afinidade. No entanto, a produção de anticorpos mercadorias tornou-se cada vez mais viável e ambos os anticorpos policlonais e monoclonais podem desempenho excelente em aplicações de captura por afinidade. Estas muitas considerações são também abrangidos em maior detalhe na referência 1.

Exemplos de como o método de lise de células e escolha do meio de afinidade podem afectar os resultados são ilustrados na Figura 1. Exemplos de efeitos exercidos por diferentes extractores pode ser visto nas referências 1,11,24. Porque estes e outros parâmetros experimentais afetar a qualidade da captura por afinidade, tornando-se difícil discriminar PQ, repositórios de "proteomas de contas" e abordagens computacionais para eliminar os contaminantes não-específicas foram desenvolvidas para auxiliar na identificação PQ 40-43. No entanto, tais abordagens única substitute para preparação de amostras ideal para um grau limitado 59. Observando as melhores práticas e empiricamente otimizar a experiência de captura por afinidade irá fornecer as amostras da mais alta qualidade para as análises a jusante, discutido abaixo. Uma prática facilmente implementado que pode melhorar a pureza da amostra é de eluição nativa. eluição nativa é mais frequentemente usado para obter o isolado complexo de proteínas de afinidade, intacto, para posterior experimentação; mas como acontece muitas vezes aumenta a pureza da amostra, pode também ser usado apenas por esta razão. No entanto, como demonstrado na Figura 1, o painel II, a capacidade de eluição nativo para melhorar a pureza da amostra pode depender de uma titulação exacta da quantidade de meio de afinidade para a abundância da proteína alvo no extracto celular – quando o meio é em excesso , paratopos desocupadas podem permitir a acumulação fora do alvo de proteínas FP observáveis ​​nas fracções eluídas nativamente. Usando os reagentes e os procedimentos descritos aqui, hcomo sido a nossa experiência que o único maior contribuinte de PQ com as nossas experiências, é a própria proteína etiquetada, uma vez removido do contexto da célula viva. (Fig. 1.II e a Fig. S1). Em tais casos, os controlos de linha de células parentais que produzem proteomas irrelevantes na ausência do antigénio não são de nenhum valor prático; da mesma forma para tag somente ou Spike-in controles que são desprovidas de qualquer coisa, mas o antígeno alvo. Portanto, sempre que possível vamos implementar I-DIRT 7,38, que mede diretamente o acúmulo de interações proteína pós-lise utilizando MS quantitativos. Como mencionado no Passo 3.2.7 do protocolo, os procedimentos para eluição nativo vai variar de acordo com os detalhes do sistema de afinidade utilizado. eluição nativa é mais geralmente conseguida por deslocamento competitivo da proteína etiquetada clivagem proteolítica complexa ou da etiqueta, libertando o complexo a partir do meio de afinidade. Vários sistemas de afinidade composta de pequenos marcadores de epitopo existir, FOr que o próprio epitopo está disponível como péptido útil para a eluição competitiva de complexos de proteínas marcadas 60. Da mesma forma, várias proteases estão disponíveis para clivar especificamente locais cognatos estrategicamente colocados em afinidade com a etiqueta proteínas de fusão 61. Dependendo das especificações dos sistemas de afinidade escolhidos, podem ser adoptadas o esquema de eluição adequado.

De um modo geral, a qualidade dos resultados obtidos serão significativamente afectadas pela qualidade da preparação da amostra. É importante trabalhar com cuidado e precisão através de cada passo destes protocolos, e tão rapidamente quanto possível, mantendo o cuidado e precisão. É aconselhável controlar a partição da proteína de interesse através de cada passo para entender a eficácia de cada manipulação. Por exemplo: como é abundante da proteína de interesse na célula ou tecido em questão? Talvez a proteína em estudo (e seus complexos) será um desafio para caracterizar em massaespectrometria devido à baixa abundância. Se os complexos purificados são detectáveis ​​por coloração da proteína geral (cerca de nanogramas intervalo), espectrometria de massa é provável que tenha sucesso. Se a proteína de interesse capturado só pode ser detectada por transferência de Western quimioluminescente melhorado sensível (aproximadamente gama picograma), espectrometria de massa é menos provável que seja eficaz. Mesmo que a proteína de interesse é abundante na célula, como é abundante no extracto celular produzido? Será que a partição de proteínas para a solução ou é no pellet? Neste último caso, uma nova solução de extracção, pode ser concebido que podem melhorar a recuperação. Uma vez que o extracto de células é combinado com o meio de afinidade, o grau de eficácia é a proteína capturado? Será que a proteína permanecem ligados através de lavagens subsequentes? E quanto a outras proteínas copurifying? Ao guardar uma alíquota de cada amostra nos passos apropriados do protocolo estas perguntas podem facilmente ser respondida, tipicamente por transferência de Western contra a proteína de interesseou coloração da proteína geral, mas outros ensaios também podem ser adequados. Optimizar cada passo irá melhorar o rendimento e pureza dos complexos capturados, embora possa haver um trade-off para ser feita na maximização um atributo ou outro.

Uma aplicação típica de captura por afinidade por muitos investigadores é identificar candidato em interactores in vivo para um pequeno número de proteínas de interesse; estes candidatos são vulgarmente submetidos a validação por abordagens ortogonais in vivo para demonstrar a significância biológica dos interactores físicas. Captura de afinidade também é empregado por estudos de alta capacidade para a geração de listas de copurifying proteínas observados em uma base (quase) todo o proteoma, facilitando inferências computacionais relativos putativa em complexos vivo. Numerosos exemplos de tais estudos pode ser encontrada na literatura. Esta abordagem renuncia a optimização das condições de captura para um determinado alvo, em favor do homem exploraralvos Y; Como tal, os complexos de si inferidos são raramente recuperado totalmente intacta e altamente pura em relação a qualquer amostra. Em vez disso, as sobreposições parciais em composições observadas entre numerosas amostras capturado por afinidade distintos são usados como uma base das inferências 42. Ambas as abordagens contribuir com dados valiosos para a nossa compreensão do interactome. No entanto, um dos principais benefícios da captura de afinidade é que ele freqüentemente oferecem a oportunidade de obter os complexos intacto e altamente purificada, desde que sejam feitos esforços para otimizar o processo. Acreditamos que o futuro da abordagem reside em aumentar a facilidade e eficiência de otimizar a captura de complexos de proteínas endógenas 11, para uma avaliação mais precisa da gama de interagentes fisiológicos e utilização mais frequente em maior bioquímica jusante, enzim�ico e estudos estruturais, por exemplo, faz referência 7,9,23.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao professor Brian T. Chait por sua inestimável aconselhamento, apoio e acesso a MS instrumentação, bem como Ms. Kelly R. Molloy para excelente suporte técnico. Agradecemos Ms. Kelly nua para a sustentação com a edição de cópia. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH concede P41GM109824, P41GM103314 e P50GM107632.

Materials

Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm^2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62×44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) Retsch custom order For cryomilling (II)
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5 – 2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
  2. Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
  3. Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
  4. Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  5. Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
  6. Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
  7. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
  8. Liu, J. -. J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -. Y., Ke, A., Wang, H. -. W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
  9. Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
  10. Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
  11. Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
  12. Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  13. Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  14. Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
  15. Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
  16. Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
  17. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
  18. Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
  19. Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. , 1-6 (2012).
  20. Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
  21. Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
  22. Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
  23. Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
  24. LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
  25. Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells. , (2011).
  26. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. . Basic Cell Culture Protocols. 946, (2013).
  27. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
  28. Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
  29. Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  30. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
  31. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
  32. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  35. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  36. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
  37. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
  38. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
  39. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
  40. Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
  41. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
  42. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1 (2005).
  43. Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839 (1999).
  44. Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
  45. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
  46. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
  47. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
  48. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
  49. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
  50. Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  51. Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
  52. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201 (2012).
  53. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm?. Cell. 30 (2), 345 (1982).
  54. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  55. Kalkum, M. . Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, (2003).
  56. Staley, J. . Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , (2005).
  57. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
  58. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
  59. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).

Tags

Protein ComplexAffinity CaptureCryomilledMammalian CellsCell BiologyMolecular BiologyProtein InteractionsPBSCell PelletLiquid NitrogenCell Lysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image