从Cryomilled哺乳动物细胞中的蛋白质复合物亲和捕获

1.细胞收集和冷冻使用适当的培养条件为感兴趣25,26的细胞系生长1-8 G细胞的材料。这个协议是最多8克细胞（〜10 9个细胞），从参考文献19,27,28改性优化。通常，〜5克的HEK-293或HeLa细胞可以从生长8500厘米2培养板，以〜90％汇合得到的。 注意：这些协议使用液氮（LN 2），能引起严重的低温灼伤的。唐防护服和运动适当的处理措施。 倒出生长培养基（废物）成一个大烧杯中。 广场上冰的培养皿中的一个大的矩形冰锅。 20毫升冰冷的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）添加到培养皿，并用大细胞刮刀释放从盘的细胞;细胞转移到50毫升管中，预先在冰上冷却;举办冰上管。 注意：对于所有细胞操作步骤使用电动移液器设置为“低”和25ml移液器，以避免在传输操纵细胞过度剪切。安排50毫升收集管，并在冰桶启动过程之前1倍PBS中。 另外的10毫升冰冷的1×PBS中的添加到同一个盘。收集剩余的细胞，并将它们转移到50毫升管。 重复每道菜;从不同的菜细胞悬液可被组合，以减少取样数和废塑料。 注意：由于细胞本身不会构成悬架体积的相当大的比例，三个板值得细胞悬浮液的可组合成两个50毫升管。因为50ml试管实际持有比标称容量多，八板通常可以在五个这样的管蔓延。 离心机在1000 xg离心，4℃5分钟。 小心倒出上清。重悬在10毫升冰冷的1×PBS中每个粒料。巩固地区环境部门一道spended粒料，最多5每50毫升管，以减少取样数。 离心5分钟在1000 XG，4℃。 小心倒出上清。重悬在10毫升冰冷的1×PBS中的沉淀从20毫升注射器中取出柱塞并将它放在一边。帽注射器的喷嘴和细胞悬浮液转移到它。 放置注射器50毫升管中并离心5分钟内以1000 xg离心，4℃。 吸出上清液与连接到一个真空阱系统，直到刚刚细胞的顶层细尖吸管开始被吸上来。这导致在潮湿的细胞沉淀。 开盖注射器，插入柱塞并直接滴落细胞进入的大塑料烧杯装满LN 2，在一个聚苯乙烯泡沫塑料箱的LN 2浴保持。强制沉浸从注射器的剩余细胞。 通过倾倒转移冷冻的细胞至50ml管中。松散帽管，以让多余的液氮蒸发;担任船长在-80℃下摆过夜。完全拧紧瓶盖的第二天。将冷冻的细胞可在-80℃保存以这种方式，直到低温球磨。 注意：所有的LN 2已明显蒸发之前，不要盖紧管，否则过大的压力可能会导致管爆炸。不封闭管中的液氮消散后，可能会导致对细胞材料霜的积聚，加入过量的水的重量，有效地减少了在碾磨的蛋白浓度。 2.冷冻细胞的破坏低温注：铣削和操作所有工具应预先冷却，2 LN。一个小酒瓶将需要添加的jar在2 LN和浇2 LN在封闭的研磨罐的顶部。自制工具显示在参考19。低温手套将需要处理LN 2冷却研磨设备。铣削这里使用的罐子的盖子（见材料表 ）通常安装有橡胶垫船;这将需要使用市售的聚四氟乙烯盖密封垫片可靠地执行以下方案来代替。此外，由于由气态N 2压力可在研磨过程中建立起来的罐子内的较高水平，我们建议您安装市售的5条/ 500千帕的压力阀作为安全释放预防措施28。 从-80℃贮存去除细胞珠和持有50毫升管架在液氮浴。 预冷却50毫升的容器，二20毫米球，和盖在含有2 LN干净矩形冰桶。如果使用一个预冷却所述聚四氟乙烯（PTFE）绝缘体;任一组的冰球（见附图27），或一个套筒和-冰球（ 见图2）。预冷却完成时LN 2镇静的剧烈沸腾。 上设置适当的平衡磨。 注意：这将等于罐子，瓶子盖的质量，所使用的研磨球，和要加入到该罐的细胞的数量。如果使用任何PTFE绝缘体，它们的质量也应包含在内。我们建议记录瓶，盖的群众，和球（和它们的组合质量，包括使用的任何绝缘体）提前和记录它们存储磨坊附近一个信息表。 使用镊子，将两个预冷却20毫米研磨球和冷冻细胞预冷研磨罐内。 注：由于罐子，球表面研磨过程中材料的小损失，回收的材料会随着细胞的研磨的质量增加的百分比。所描述的方法，材料损失是非常温和的，是-0.3克湿重细胞（WCW）的顺序。制造商的指导方针指示样品的最大体积装载应罐体积的〜1/3 29球的总体积应为〜1/3和Remaining〜1/3个免费空间是用于球的自由流动。 加入2 LN的罐子高达约半满，放在罐子盖和装配转移到磨。 注意：如果使用一个首先安装选定的绝缘体。 钳装配到位，并执行使用下面的程序铣削三个周期：400转，3分钟，反向旋转，每分钟，无间隔休息。冷静了2 LN的研磨罐在每个周期之间。 注：在铣削球在行星运动罐子内碰撞产生不同的clunking噪音。如果没有听到这些声音，铣没有发生。终止铣削循环，不要指望这个周期，将罐子装配回2 LN并检查罐子的内容。确保没有冰已经形成，如果它有，用预冷却的抹刀芯片其从罐壁离开。从步骤2.5再次启动。 如果不使用绝缘体或绝缘体的冰球，将罐子装配回LN <sUB> 2周期之间重新冷静，加2至LN〜½满各一次。该LN 2加入将罐子作为罐子增加铣削时的温度范围内蒸发。这导致了罐中的压力积聚。因此，脱离自磨机罐子时，松开钳非常缓慢。如果夹紧迅速释放，细胞粉可以与快速减压逸出。夹具的缓慢释放允许从在温和的，受控的方式将罐逸出的压力，并防止细胞材料的损失。气态N 2柔和的逃生经常可以听到嘶嘶的钳慢慢释放-这是正常的。 如果使用的套筒和冰球绝缘体，罐子组件可以在磨机左和LN 2加入到绝缘体/罐组件在原地 。 移动罐回到2 LN，并让暂时休息降温。如果使用的套筒和冰球绝缘体，罐子可以从内套去除第i个2铲的帮助下，对任何一方提供的杠杆作用。一旦罐被LN 2休息，小心取出盖子，使用镊子除去滚珠，并用预冷的刮刀将粉末转移到预冷的50ml管中。加入少许LN 2的开瓶/粉可以帮助移除该结块到粉球，删除它们之前。 注意：一旦罐已经打开，取出球前2 LN少量添加到它。这将有助于恢复结块的表面上的粉末。细胞粉末应在-80℃或更低直至使用举行。在我们的经验，细胞粉可以存储在这种方式，基本上无限期，在不影响性能。 从细胞提取物蛋白复合物3.亲和捕获注意：以下协议实现了与感兴趣，共同的蛋白相互作用包括亲和配体的亲和介质，诱饵，或抗体upled至微米级的顺磁珠。这些可以在内部19,30来制备，使用商购的试剂盒，或购买作为现成的试剂。 细胞提取物的制备注意：当处理细胞粉，记得用器皿和管预冷与2 LN。含电池粉管时，应该始终不能在-80℃举行2 LN。放置含细胞粉末在管架，在一个泡沫聚苯乙烯容器LN 2 50毫升管（多个）。 称出100毫克的细胞粉的成1.5或2 ml离心管。 注：我们观察到细胞的这个量是一个很好的起点，通常会得到目标蛋白在几十到几百毫微克以每秒数千份亲和捕获的适度表达的蛋白（〜50kDa的质量后的范围，目前细胞），假定目标的提取和捕获效率是≳70％。这样的收益率提供了直接visualiz通过SDS-PAGE和蛋白染色的纯化的级分的通货膨胀。 去皮分析天平与空离心管。细胞分装成粉用液氮冷却匙或锅铲管。检查分析天平管内分配的粉末的质量。 注意：为了方便称出细胞的粉末，也可以使用小体积测量匙。这些已发现，得到可重复的结果（见附图19）。我们发现用螺丝帽或'安全锁'离心管中最好的结果。压力从蒸发LN 2可能进入管会导致标准离心管，只是在加入萃取溶液之前弹出后续变暖期间开-潜在地导致样品的损失。 打开管（或拧松螺丝帽）与细胞粉末静置在室温1分钟。这样就释放了管内的压力，并防止抽出的立即冻结溶液时添加到该粉末中。这1分钟孵化过程中没有解冻观察。 加入400微升萃取辅以蛋白酶抑制剂和漩涡简单地说，然后在冰上举行，同时继续执行步骤3.1.5。样品应全部随后的操作之间举行冰上直到洗脱。 注意：提取剂的最佳组合物取决于蛋白质复合物（ES）来进行纯化。一些一般性的指导表1和支持提供参考。 使用微尖超声发生器给样品一个简短的低能量脉冲驱散任何集合体。 （超）超声有4个脉冲（每2秒，2 A;约15-20总能量J） 注：涡旋分送小区粉末进入萃取剂，但根据不同的解决方案，字符，一些聚集体可以观察到。我们已发现，分散这些聚集体提供了随后的亲和捕获期间的最佳产率。一个简短的微尖SONI阳离子分散轻易这些聚集体。该解决方案应该出现半透明，但均匀，无明显聚集。水浴sonicators往往过于低功率高效地分散这种聚集而不显著更长的样品处理时间，但可以是适于与适当的设置。 通过离心澄清提取物（ 如20,000 xg离心，10分钟，4℃）。 注意：澄清的细胞提取物的等分试样可被保存用于比较到颗粒中，亲和捕获后上清液中的内容，并从亲和介质洗脱后获得的级分，以确定提取的目标蛋白质的效率和捕获， 例如，通过免疫印迹（见讨论）。 去除上清（澄清的提取物），并继续进行亲和捕获。 注：在SDS-PAGE上样缓冲液将沉淀可以重新萃取在70℃，以确定目标蛋白的D释放的程度通过比较在步骤3.1.6中获得的提取物uring初始非变性提取。 亲和捕获 预洗磁亲和力网上平台。这可以在细胞提取物被离心来完成。 放置在磁体的管（多个）。珠粒会积聚在管的秒内的侧面，允许要删除的存储解决方案。 加入500μl的提取液来珠。简言之涡结构中速（足以悬浮）。脉冲旋管在微型离心机收集所有内容的底部。这样做可以确保解决方案的最低结转。放置在磁体管和吸出溶液。 注：具有鲜明特色的磁介质可从各种商业供应商。结果可以根据这些特征，包括珠尺寸，均匀性，表面涂层，和抗体偶联化学变化。并排-SI在应用程序中去解决审判上的选择试剂之前推荐的。 经澄清的细胞提取物转移到含有-预洗的亲和力中，涡旋简单地悬浮1.5-2.0毫升管发起亲和捕获。 孵育在4℃下与一旋转轮连续温和混合30分钟;珠应在整个孵化继续停牌。 脉冲旋管在微型离心机收集所有内容到管的底部。吸出上清液，并在步骤3.2.3描述用1ml冷提取液洗珠三次。放置在管上的磁铁。除去溶液。继续添加下一个解决方案，并重复。在第2 次洗涤，通过移液转移珠和洗涤溶液一起到新鲜的离心管。这降低样品污染，在洗脱的点，通过用于与叔孵育吸附在管的壁无规蛋白他细胞提取物。第3 次洗涤后，将珠粒应脉冲纺丝简要地在微型离心机收集所有内容的底部。将管回到了磁铁，并删除任何残留液体。这使得洗脱，确保洗脱的样品将有统一的卷之前去除溶液的最后几微升。它也保证了洗脱将是有效的，作为洗脱溶液将不会被剩余洗涤稀释;这种残基也可以向盐效果和改变蛋白质在SDS-PAGE迁移（见下文）。 注：后结合物上清液的等分试样可被保存用于比较在3.1.6中产生的澄清的提取物。通过免疫印迹。结果将表示从细胞提取物中的靶蛋白的耗尽的程度。 洗脱在任何一个天然或变性的方式;考虑战略最好的下游应用1。 注：本地洗脱strategie的细节旨意取决于所用的亲和标签（见讨论）。对于大多数用户来说，变性，用SDS-PAGE样品缓冲液随后将样品通过SDS-PAGE用蛋白染色31的分析洗脱，将是最实用的初始方法。 注：样品缓冲液将取决于电泳系统上的组合物被使用。许多实验室投下自己的Tris甘氨酸凝胶，利用电泳断续和拉姆力缓冲系统32-34。一个常见的样品缓冲液配方（1×），包括：10％（重量/体积）蔗糖，50毫摩尔DTT，2％（重量/体积）SDS，62.5毫摩尔Tris-氯pH值8.8，0.0004％（重量/体积）溴酚蓝31 。我们建议准备1.1倍的股票，省略DTT。 1/10的500mM DTT的体积应的SDS-PAGE之前，加入到样品中（见下文）。许多市售的SDS-PAGE系统也可用;这些可以包括特定于系统的样品缓冲液。 添加SDS-PAGE样品缓冲液中不还原剂（以减轻释放从珠粒抗体链）和孵育在室温下搅拌5-10分钟。 注意：这将与大多数基于亲和力的相互作用干扰，释放捕获的蛋白质到上清液。更持久的相互作用可能从高温受益释放（通常70℃就足够了）。 收集并保存上清。样品可以在-20℃下短暂存储（几天）被冻结或-80℃下长期储存，直到分析是需要的。 若使试样进行SDS-PAGE，接着用标准技术31蛋白染色。 MS可以用于表征样品组合物1。个别蛋白质条带可以被切除以识别或整个样本可通过电泳样品只简单（4-6毫米到凝胶），并与样品中一起处理所有蛋白质作为来表征在一个单一的分析“凝胶塞。” 注：初始前加入DTT婷电泳。如果计划进行MS，样品可以是电泳后35烷基化;然而，这是经常电泳36之前更方便烷基化物。