La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Este protocolo permite la manipulación de la ploidía en embriones de pez cebra, como en la generación de los diploides ginogenéticos homocigotos de haploides ginogenéticos (Figura 1) o la producción de tetraploides. Esto se logra mediante la inducción de un retraso en la citocinesis correspondiente a exactamente un ciclo celular (Figura 2A, 2B). El retardo de tecla de un ciclo en la citocinesis se logra mediante el tratamiento con choque térmico. El protocolo estándar de choque térmico (HS) como se describe originalmente por Streisinger y colegas involucrado un pulso de temperatura durante el período de 13 a 15 MPF, resultando en un puesto de la división celular de un ciclo durante el primer ciclo celular ^1. La eficiencia de este protocolo se ha mejorado recientemente mediante el escaneo de los ciclos tempranos de la célula con una ventana temporal de deslizamiento de tratamiento de choque térmico. Esta exploración identificado un punto de tiempo más tarde para un choque térmico, todavía dentro de la primera del ciclo celular (22-24 MPF), que resulta en una mayor tasa de EMBRyos con un puesto de la división celular de un ciclo, que en este caso afecta al segundo ciclo celular ^2. La observación de que las manipulaciones experimentales durante el primer ciclo celular interfieren con la división celular durante el segundo ciclo celular y causan ADN duplicación de contenido también se ha informado en otras especies de peces ^3,4. Nos referimos a este protocolo modificado como Heat Shock 2 (HS2 – el término "2" indica que el impulso de calor se produce en un momento más tarde que el método uniforme del SA, y que el retraso del ciclo celular causada por HS2 se produce durante el segundo ciclo celular ). Estos estudios mostraron que la base de detención citocinesis después de choque térmico es la inhibición de la duplicación centriolo durante el impulso de calor, lo que afecta a la formación del huso y la inducción surco en el siguiente ciclo celular. Resultados de HS2 en los rendimientos de la detención del ciclo celular se acercan al 100%, y las tasas de ploidía la duplicación hasta 4 veces más altos que ^la norma ² del SA.

ingenio embriones tratadosja choque térmico durante el ciclo celular blastómeras presentan muchos efectos nocivos, lo que sugiere que el choque térmico afecta a múltiples procesos necesarios para la división celular ^2. Por otra parte, si se aplica el choque térmico antes de la iniciación de ciclo celular (período de tiempo de 0-30 MPF), que parece tener efectos consistentes con la interferencia específica con la duplicación centriolo y no parece afectar a otros procesos celulares esenciales ² . Estos estudios mostraron que el tiempo antes de la iniciación de la división de blastómeros que parece ser un período de desarrollo susceptibles a la utilización de choque térmico como una herramienta para manipular específicamente ploidía través de la inhibición de centríolos. La causa subyacente de la selectividad aparente para el choque de calor en la duplicación centríolo es desconocida, pero puede estar relacionado con una degradación selectiva de subestructuras centrosoma observados bajo el estrés por calor en ciertos tipos de células, tales como leucocitos ^5.

la sincronización temporal de la de embrionariodesarrollo se logra mediante la fertilización in vitro (FIV). El uso de espermatozoides sin tratar durante resultados de fertilización in embriones diploides que al HS2 inducida por un ciclo de parada citocinesis convertido tetraploide. El uso de espermatozoides con tratamiento UV, que lleva entrecruzamientos que inactivan su ADN, da lugar a embriones haploides ginogenéticos ^6, que tras inducida por hsü un ciclo de parada citocinesis convertirse diploides ginogenéticos ^2. Debido a la duplicación del genoma completo resultante, las últimas diploides ginogenéticos son homocigotos en cada locus en todo el genoma. Por razones de concisión, nos referimos a ginogenéticos embriones haploides como "haploides", y los embriones diploides homocigóticos ginogenéticos como "diploides homocigóticos". Si viables y fértiles, diploides homocigóticos se pueden utilizar para iniciar líneas estéril y libre de letales. homocigosis directa inducida por HS2 también debería incorporarse fácilmente en el análisis genético o cribados genéticos, ya que los diploides homocigotos de hembras que son portadores heterocigotos de mutlas tasas de exposición ations de homocigosidad en (50%) y altas relaciones de fijos ^2.

El siguiente protocolo describe pasos para realizar HS2 e inducir la duplicación ploidía con plena homocigosis. Para la producción de tetraploides, solución de espermatozoides debe ser tratada. Para la producción diploide homocigotos, el esperma debe ser inactivado mediante tratamiento UV. Además, como se describe en la discusión, marcadores de pigmentos visibles pueden también ser usados ​​para facilitar la identificación de los diploides homocigóticos. Compañero de pez cebra principalmente durante las primeras 3 horas del inicio de su ciclo ^de luz ^7, y tanto los adultos como los huevos son sensibles a los ritmos circadianos ^8, por lo que para obtener mejores resultados debe producirse la fecundación in vitro dentro de este período de tiempo.