التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج
Summary
يستخدم بروتوكول تعديل للتلاعب الصيغة الصبغية صدمة الحرارة للحث على المماطلة دورة واحدة في الانقسام السيتوبلازمي في الجنين في وقت مبكر. ويتجلى هذا البروتوكول في الزرد ولكن قد تكون قابلة للتطبيق على الأنواع الأخرى.
Abstract
التلاعب في الصيغة الصبغية يسمح للتحولات مفيدة، مثل diploids إلى الرباعي، أو haploids إلى diploids. في rerio دانيو الزرد، وتحديدا توليد diploids gynogenetic متماثل مفيد في التحليل الجيني لأنه يسمح بالإنتاج المباشر من أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل من أم متخالف واحدة. توضح هذه المقالة بروتوكول تعديل الازدواجية الصيغة الصبغية بناء على نبض الحرارة خلال دورة الخلية الأولى، الحرارة صدمة 2 (HS2). من خلال تثبيط الازدواجية المركزيه، النتائج هذه الطريقة في الدقيقة كشك انقسام الخلية خلال دورة الخلية الثانية. في الدقيقة دورة واحدة تقسيم كشك، بالإضافة إلى ازدواجية الحمض النووي لم تتأثر، النتائج في كامل الازدواجية الجينوم. وتشمل البروتوكولات المرتبطة بهذا الأسلوب البيض وجمع الحيوانات المنوية، والعلاج بالأشعة فوق البنفسجية من الحيوانات المنوية، والتخصيب في المختبر ونبض حرارة أن يتسبب في خلية واحدة تأخير تقسيم دورة والازدواجية الصيغة الصبغية. ويمكن تطبيق نسخة معدلة من هذا البروتوكولللحث على التغييرات الصيغة الصبغية في الأنواع الحيوانية الأخرى.
Introduction
يسمح هذا البروتوكول التلاعب الصيغة الصبغية في الأجنة الزرد، كما هو الحال في توليد diploids gynogenetic متماثل من haploids gynogenetic (الشكل 1) أو إنتاج الرباعي. ويتحقق ذلك عن طريق إحداث تأخير في السيتوبلازمي الموافق بالضبط دورة خلية واحدة (الشكل 2A، 2B). ويتحقق المفتاح تأخير دورة واحدة في الانقسام السيتوبلازمي عن طريق العلاج مع الصدمة الحرارية. وتضمن البروتوكول القياسي من الحرارة صدمة (HS) كما هو موضح في الأصل من قبل Streisinger وزملاؤه نبض درجة الحرارة خلال MPF فترة 13-15، مما أدى إلى دورة واحدة انقسام الخلايا كشك خلال أول دورة الخلية 1. كفاءة هذا البروتوكول قد تحسنت في الآونة الأخيرة عن طريق مسح دورات الخلية الأولى مع انزلاق نافذة الزمني لمعالجة الصدمة الحرارية. هذا المسح تحديد نقطة زمنية لاحقة لصدمة الحرارة، لا يزال ضمن دورة الخلية الأولى (22-24 MPF)، الذي يؤدي إلى ارتفاع معدل EMBRيوس مع دورة واحدة كشك انقسام الخلايا، مما يؤثر في هذه الحالة الخلية الثانية دورة 2. كما تم الإبلاغ عن ملاحظة أن التلاعب التجريبية خلال دورة الخلية الأولى تتداخل مع انقسام الخلية خلال دورة الخلية الثانية وتسبب الحمض النووي ازدواجية المحتوى في غيرها من أنواع الأسماك 3،4. نشير إلى هذا البروتوكول تعديلها حسب الحرارة صدمة 2 (HS2 – مصطلح "2" يعكس أن النبض الحرارة يحدث في نقطة زمنية لاحقة من طريقة HS القياسية، وأن تأخير دورة الخلية الناجمة عن HS2 يحدث خلال دورة الخلية الثانية ). وأظهرت هذه الدراسات أن أساس اعتقال السيتوبلازمي بعد الصدمة الحرارية هو تثبيط الازدواجية المركزيه خلال نبض الحرارة، مما يؤثر على تكوين المغزل وتحريض ثلم في دورة الخلية التالية. النتائج HS2 في غلة اعتقال دورة الخلية تقترب من 100٪، ومعدلات تكرار الصيغة الصبغية تصل إلى 4 أضعاف HS القياسية 2.
الأجنة تعامل الطرافةها الصدمة الحرارية خلال قسيم أرومي خلية الدراجات يحمل العديد من الآثار الضارة، مما يوحي بأن الصدمة الحرارية يؤثر على عمليات متعددة اللازمة لانقسام الخلية 2. من ناحية أخرى، إذا تم تطبيق الصدمة الحرارية قبل الشروع في ركوب الدراجات الخلية (الفترة الزمنية 0-30 MPF)، ويبدو أن يكون لها آثار تتفق مع تدخل معين مع الازدواجية المركزيه ولا يبدو أن تؤثر عمليات الخلية الأساسية الأخرى 2 . وأظهرت هذه الدراسات أن الوقت قبل الشروع في تقسيم قسيم أرومي يبدو أن فترة تنموية قابلة للاستخدام الصدمة الحرارية كأداة للتلاعب على وجه التحديد الصيغة الصبغية من خلال تثبيط المركزيه. السبب الكامن وراء انتقائية واضحة لالصدمة الحرارية على الازدواجية المركزيه غير معروف، ولكن قد تكون ذات صلة إلى تدهور الانتقائي للالأساسات الجسيم المركزي لوحظ تحت الإجهاد الحراري في أنواع الخلايا معينة، مثل الكريات البيض 5.
تزامن الزمني للدي الجنينيةويتحقق اإلنمائية التي كتبها التخصيب في المختبر (IVF). استخدام الحيوانات المنوية غير المعالجة خلال النتائج الإخصاب في الأجنة مضاعفا أنه عند HS2 الناجم عن دورة واحدة السيتوبلازمي كشك يصبح رباعي الصيغة الصبغية. استخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية، والذي يحمل crosslinks أن تعطيل الحمض النووي، والنتائج في الأجنة فرداني gynogenetic 6، التي تقوم عليها HSII الناجم عن دورة واحدة السيتوبلازمي المماطلة أصبحت diploids gynogenetic 2. بسبب ينجم عن ذلك من ازدواجية الجينوم كاملة، وdiploids gynogenetic الأخير هم متماثل في كل مكان واحد عبر الجينوم. لالايجاز، فإننا نشير إلى gynogenetic الأجنة فرداني باسم "haploids"، ومتماثل الأجنة مضاعفا gynogenetic باسم "diploids متماثل". إذا قابلة للحياة وخصبة، diploids متماثل يمكن استخدامها لبدء خطوط معقمة وخالية المميتة. زيجوت متماثلة الألائل المباشر الناجم عن HS2 كما ينبغي أن يدرج بسهولة إلى التحليل الجيني أو شاشات الوراثية، منذ diploids متماثل من الإناث التي هي ناقلات متخالف من موتمعدلات المعرض بالجمع من زيجوت متماثلة الألائل في (50٪) نسب عالية وثابتة 2.
يصف بروتوكول التالية الخطوات لتنفيذ HS2 وحمل الازدواجية الصيغة الصبغية مع زيجوت متماثلة الألائل الكامل. لإنتاج رباعي الصيغة الصبغية، وينبغي أن يكون الحل الحيوانات المنوية غير المعالجة. لإنتاج مضاعفا متماثل، يجب المعطل الحيوانات المنوية عن طريق العلاج بالأشعة فوق البنفسجية. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو موضح في مناقشة، علامات الصباغ واضحة يمكن أن تستخدم أيضا لتسهيل تحديد diploids متماثل. زميله الزرد في المقام الأول خلال ساعة 3 الأولى من بدء دورة ضوءها 7، والكبار على حد سواء والبيض حساسة لإيقاعات الساعة البيولوجية 8، وذلك لأفضل النتائج ينبغي أن يحدث إجراء عمليات التلقيح الصناعي غضون هذه الفترة الزمنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة
فمن الأهمية بمكان أن تعمل في ظل ظروف فعالة التخصيب في المختبر. لضمان امدادات جيدة من البيض نضجا (الخطوة 1)، مجموعة تصل الإناث للتزاوج لا ينبغي أن تم وضعها في التقاطعات التزاوج لمدة 5 أيام على الأقل، ويجب أن يظهر حامل. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.
Materials
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 5 | see above | see above | 1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4°C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. . The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank’s saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. . Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).
