Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo's met Heat Shock 2 Treatment

Dit protocol maakt de manipulatie van ploïdie in zebravisembryo's, bijvoorbeeld bij het genereren van homozygote diploïde gynogenetic van gynogenetic haploïden (figuur 1) of de productie van tetraploïden. Dit wordt bereikt door het induceren van een vertraging in cytokinese overeenkomt met precies een celcyclus (Figuur 2A, 2B). De sleutel van één cyclus vertraging cytokinese wordt bereikt door behandeling met hitteschok. Het standaardprotocol van hitteschok (HS) zoals oorspronkelijk beschreven door Streisinger en collega betrokken temperatuur puls gedurende de periode 13-15 MPF, resulterend in één cyclus celdeling stall tijdens de eerste celcyclus ^1. De efficiëntie van dit protocol is onlangs verbeterd door het scannen van de eerste celdelingen met een glijdende vensterfuncties van hitteshockbehandeling. Deze scan identificeerde een later tijdstip voor een warmteschok, nog binnen de eerste celcyclus (22-24 MPF), wat resulteert in een hoger embryos met één cyclus celdeling box, die in dit geval beïnvloedt de tweede celcyclus ^2. De waarneming dat experimentele manipulaties in de eerste celcyclus verstoren celdeling tijdens de tweede celcyclus en leiden tot DNA-inhoud duplicatie is eveneens beschreven in andere vissoorten ^3,4. We noemen dit gemodificeerde protocol Heat Shock 2 (HS2 – de term "2" geeft de warmte puls plaats op een later tijdstip dan de standaard HS methode, en dat de celcyclus vertraging veroorzaakt door HS2 optreedt in de tweede celcyclus ). Deze studies toonden aan dat de basis voor cytokinese arrestatie na hitteschok de remming van centriole overlapping tijdens de hitte puls, welke spil vorming en groef inductie in de volgende celcyclus beïnvloedt. HS2 resultaten in opbrengsten van de celcyclus bijna 100%, en de tarieven van ploïdie duplicatie tot 4 keer hoger dan standaard HS ^2.

Embryo's behandeld witha heat shock tijdens blastomere celdeling vertonen veel schadelijke effecten, wat erop wijst dat heat shock invloed op meerdere processen die nodig zijn voor de celdeling ^2. Anderzijds, indien de heat shock voorafgaand aan de initiatie van celdeling (tijdsperiode 0-30 MPF) wordt toegepast, blijkt het effect consistent met specifieke interferentie met centriole overlapping hebben en lijkt geen andere essentiële cellulaire processen beïnvloeden ² . Deze studies toonden aan dat de tijd voorafgaand aan de inleiding van blastomere divisie lijkt een ontwikkelingsperiode vatbaar is voor het gebruik van Heat Shock als een instrument om specifiek te manipuleren door middel van ploïdie centriole remming zijn. De onderliggende oorzaak van de schijnbare selectiviteit voor warmteschok op centriole duplicatie is niet bekend, maar kan verband houden met een selectieve afbraak van centrosoom substructuren waargenomen onder hittestress in bepaalde celtypen, zoals leukocyten ^5.

Tijdelijke synchronisatie van de embryonalekeling wordt bereikt door in vitro fertilisatie (IVF). Het gebruik van onbehandelde sperma tijdens de bevruchting resulteert in diploïde embryo's dat bij HS2-geïnduceerde één cyclus cytokinese kraam tetraploïde geworden. Het gebruik van UV-behandelde sperma, die verknopingen dat zijn DNA inactiveren, leidt gynogenetic haploïde embryo ^6, dat bij HSII geïnduceerde één cyclus cytokinese stall worden gynogenetic diploïde ² draagt. Door het resulterende gehele genoom duplicatie deze gynogenetic diploïden homozygoot bij elke locus in het genoom. Beknoptheid wordt verwezen naar haploïde embryo gynogenetic als "haploïden" en homozygote gynogenetic diploïde embryo's "homozygote diploïde". Als levensvatbaar en vruchtbaar, kunnen homozygote diploïde worden gebruikt om steriele en dodelijke-vrije lijnen te starten. Direct homozygosity geïnduceerd door HS2 moet ook gemakkelijk worden opgenomen in genetische analyse of genetische screens, omdat homozygote diploïde zijn van koeien die heterozygote dragers van mut zijnaties vertonen tarieven van homozygotie bij hoge en vaste (50%) verhoudingen ^2.

Het volgende protocol beschrijft de stappen om HS2 presteren en induceren ploïdie overlapping met de volledige homozygosity. Voor tetraploïde productie moet sperma oplossing onbehandeld zijn. Voor homozygote diploïde productie moet sperma worden geïnactiveerd door UV-behandeling. Bovendien, zoals beschreven in de discussie, zichtbaar pigment markers kunnen ook worden gebruikt om identificatie van homozygote diploïde vergemakkelijken. Zebravis mate in de eerste plaats tijdens de eerste 3 uur na de opening van hun licht cyclus ^7, en zowel volwassenen en eieren zijn gevoelig voor circadiaanse ritmes ^8, dus voor het beste resultaat van de IVF-procedure moet plaatsvinden binnen deze periode.