熱ショック2処理とゼブラフィッシュ胚の倍数性マニピュレーション

このプロトコルは、雌性発生半数体（ 図1）または四倍の生産からホモ接合雌性発生二倍体の世代のようにゼブラフィッシュ胚における倍数性の操作を可能にします。これは、正確に1つの細胞周期（ 図2A、2B）に対応する細胞質分裂の遅延を誘導することによって達成されます。細胞質分裂において重要な1サイクルの遅延がヒートショックで処理することにより達成されます。もともとStreisingerらによって記載されるように熱ショック（HS）の標準プロトコルは、最初の細胞周期¹の間に1サイクル細胞分裂停止を生じ、期間13-15 MPF時の温度パルスを含みました。このプロトコルの効率は、最近、熱ショック処理のスライディング時間窓を用いて初期の細胞周期をスキャンすることによって改善されています。このスキャンは、まだ最初の細胞周期（22-24 MPF）内で、熱ショックのための後の時点を同定し、そのEMBRの高いレートでの結果この場合、第2の細胞周期^2に影響^を与える1サイクル細胞分裂停止とYOS。最初の細胞周期中の実験操作は、第二の細胞周期の間に細胞分裂を妨害し、DNAにコンテンツの複製を引き起こす観察は、他の魚種^3,4に報告されています。用語「2」熱パルスが標準HS法よりも後の時点で発生すること、およびHS2によって引き起こされる細胞周期の遅延は、第二の細胞周期の間に発生することを反映する – 私たちは、熱ショック2（HS2、この修正されたプロトコルを参照します）。これらの研究は、熱ショック後に細胞質分裂停止のための基礎は、以下の細胞周期における紡錘体形成および溝誘導に影響を与える熱パルス、中中心小体複製の阻害であることが示されました。 HS2の100％に近づいて細胞周期停止の収量の結果、および標準HS ²の4倍の倍数性複製アップの速度。

胚扱わウィットHA割球の細胞周期の間の熱ショックは、熱ショックが細胞分裂²に必要な複数のプロセスに影響を与えることを示唆し、多くの有害な効果を示します。熱ショックは、細胞周期（期間0~30 MPF）の開始前に印加された場合に、中心小体の複製を有する特定の干渉と一致効果を有することが表示され、他の必須の細胞プロセス^2に影響^を与えていないよう。これらの研究は、前割球の分裂の開始までの時間は、具体的に中心小体阻害を介して倍数性を操作するためのツールとして、熱ショックを使用して、影響を受けやすい発育期間であるように思われることを示しました。中心小体複製の熱ショックの見かけの選択性の根底にある原因は不明であるが、白血球⁵などの特定の細胞型において熱応力下で観察中心体サブ構造の選択的分解に関連し得ます。

胚ドの時間同期velopmentは、体外受精（IVF）によって達成されます。 HS2に誘導される1サイクル分裂ストール時に四倍になる二倍体胚における受精の結果の間に未処理の精子の使用。そのDNAを不活性化架橋、1サイクルの細胞質分裂のストールは雌性発生二倍体²となっHSIIによって誘発される時に雌性発生半数体胚^6、中に結果を運ぶUV処理精子の使用。そのため、得られた全ゲノム重複の、後者の雌性発生二倍体は、ゲノム全体のすべての単一の遺伝子座でホモ接合性です。簡潔にするために、我々は「半数体」、および「ホモ接合二倍体」としてのホモ接合雌性発生二倍体胚として一倍体胚を雌性発生を参照してください。実行可能な肥沃な場合は、ホモ接合二倍体は、滅菌および致死性のない行を開始するために使用することができます。 HS2により誘発される直接的なホモ接合も容易にMUTのヘテロ接合キャリアである雌からホモ接合二倍体以来、遺伝子解析や遺伝子スクリーニングに組み込まれるべきです高い固定でのホモ接合性のations展示率（50％）比^2。

以下のプロトコルは、HS2を実行し、完全なホモ接合性と倍数性の重複を誘導する手順を説明します。四倍体製造のために、精子の解決策は、未処理でなければなりません。ホモ接合二倍体を製造するために、精子は、UV処理により不活性化されるべきです。また、議論で説明したように、目に見える色素マーカーはまたホモ接合二倍体の識別を容易にするために使用することができます。最良の結果を得るためIVF手順はこの期間内に発生する必要がありますので、主に光のサイクル^7、および両方の大人と卵の開始の最初の3時間の間にゼブラフィッシュの仲間は、概日リズム⁸に敏感です。