מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול
Summary
פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.
Abstract
מניפולציה של ploidy מאפשר טרנספורמציות שימושי, כגון diploids כדי tetraploids, או haploids כדי diploids. בשנתי ה rerio Danio דג הזברה, במיוחד בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים שימושי בניתוח גנטי משום שהיא מאפשרת את הייצור הישיר של הומוזיגוטים מאם הטרוזיגוטיים יחידה. מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה לשכפול ploidy מבוסס על הדופק חום במהלך מחזור התא הראשון, 2 הלם תרמי (HS2). באמצעות עיכוב של שכפול צנטריול, שיטה זו גורמת דוכן חלוקת התא מדויק במהלך מחזור התא השני. דוכן החלוקה חד מחזור המדויק, מצמיד את שכפול הדנ"א מעושה, תוצאה הוא שכפול הגנום כולו. פרוטוקולים הקשורים בשיטה זו כוללים ביצת אוסף זרע, UV לטיפול זרע, הפריה חוץ גופייה ודופק חום לגרום לעיכוב חלוקת מחזור אחד תאים ושכפולים ploidy. גרסה שונה של פרוטוקול זה יכול להיות מיושמתploidy כדי לגרום לשינויים בעלי חיים אחרים.
Introduction
פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה של ploidy עוברי דג הזברה, כגון בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים מן haploids gynogenetic (איור 1) או לייצור tetraploids. זו מושגת על ידי גרימת עיכוב cytokinesis המתאים מחזור התא אחת בדיוק (איור 2 א, 2 ב). מהעיכוב של מחזור מפתח cytokinesis מושג על ידי טיפול עם הלם חום. הפרוטוקול הסטנדרטי של הלם תרמי (HS) כמו במקור שתיאר Streisinger ועמיתיו מעורבים דופק הטמפרטורה במהלך MPF תקופת 13-15, וכתוצאה מכך דוכן חלוקת התא חד מחזור במהלך מחזור התא הראשון 1. היעילות של פרוטוקול זה שופרה לאחרונה על ידי סריקת מחזורי התא מוקדם עם חלון זזה זמני של טיפול בהלם חום. סריקה זו מזוהית בשלב מאוחר יותר עבור הלם חום, עדיין בתוך מחזור התא הראשון (22-24 MPF), כי תוצאות שיעור גבוה יותר של embryos עם דוכן חלוקת התא חד מחזור, אשר במקרה זה משפיע על מחזור התא השני 2. התצפית כי מניפולציות ניסיון במהלך מחזור התא הראשון להפריע חלוקת תא במהלך מחזור התא השני ולגרום DNA תוכן שכפול גם דווחה מיני דגים אחרים 3,4. אנו מתייחסים פרוטוקול שונה זה כמו חום 2 הלם (HS2 – המונח "2" משקף כי דופק החום מתרחש בנקודת הזמן יאוחר שיטת HS הרגילה, וכי עיכוב המחזור לתאים הנגרמים HS2 מתרחש במהלך מחזור התא השני ). מחקרים אלה הראו כי בסיס מעצר cytokinesis לאחר הלם חום הוא העיכוב של שכפול צנטריול במהלך הדופק החום, אשר משפיע היווצרות ציר ואינדוקצית תלם מחזור התא הבא. תוצאות HS2 בתשואות של עיכוב מחזור התא מתקרבות 100%, ושיעורים עד שכפול ploidy עד 4 פעמים גבוהות יותר מאשר תקן HS 2.
עוברים מטופלים שנינותחה הלם חום במהלך רכיבה על אופני תא blastomere מפגינים רבים השפעות מזיקות, הדבר המצביע על כך הלם החום משפיע מספר רב של תהליכים הנדרשים תא חלוק 2. מצד השני, אם הלם החום מוחל לפני תחילת רכיבת תא (פרק הזמן 0-30 MPF), זה משפיע כנראה עולה בקנה אחד עם הפרעה ספציפית עם שכפול צנטריול ואינו נראה להשפיע תהליכים בתא חיוניים אחרים 2 . מחקרים אלה הראו כי הזמן לפני התחלת חלוקת blastomere שנראה תקופת התפתחותית מקובלת באמצעות הלם חום ככלי לתמרן ploidy במיוחד באמצעות עיכוב צנטריול. הגורם הבסיסי של הסלקטיביות לכאורה הלם חום על שכפול צנטריול אינו ידוע, אך עשוי להיות קשור שפלה סלקטיבית של substructures centrosome נצפה תחת עומס חום בסוגי תאים מסוימים, כגון לויקוציטים 5.
סנכרון זמני של דה העובריvelopment מושגת על ידי הפריה חוץ גופית (IVF). השימוש בתרומת זרע מגבר מטופל במהלך תוצאות הפריה בעוברים דיפלואידי שעם HS2 הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך tetraploid. השימוש בתרומת זרע מגבר שטופלו UV, אשר נושאת crosslinks כי להשבית DNA, תוצאות בעוברים gynogenetic הפלואידים 6, שעם HSII הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך 2 gynogenetic diploids. בגלל שכפול הגנום כולו וכתוצאה מכך, את diploids gynogenetic האחרון הם הומוזיגוטים בכל מוקד יחיד בגנום. לקבלת תמציתיות, אנו מתייחסים gynogenetic עוברים הפלואידים כמו "haploids", ועוברים דיפלואידי gynogenetic הומוזיגוטים כמו "diploids הומוזיגוטים". אם קיימא ופורה, ניתן להשתמש diploids הומוזיגוטים ליזום קווי סטרילי וקטלני חינם. homozygosity ישיר המושרה על ידי HS2 צריך גם לשלב בקלות ניתוח גנטי או מסכי גנטי, מאז diploids הומוזיגוטים מן הנקבות כי הם נשאים הטרוזיגוטיים של mutשיעורי תערוכת ations של homozygosity בבית גבוה וקבוע (50%) יחסים 2.
הפרוטוקול הבא מתאר צעדים לביצוע HS2 ולגרום שכפול ploidy עם homozygosity מלא. לייצור tetraploid, פתרון הזרע צריך להיות מטופל. לייצור דיפלואידי הומוזיגוטים, הזרע צריך להיות מומת על ידי טיפול UV. בנוסף, כפי שמתואר הדיון, סמני פיגמנט גלויים יכולים לשמש גם כדי להקל על זיהוי של diploids הומוזיגוטים. תאומת דג זברה בעיקר במהלך השעות 3 הראשונות של הייזום של מחזור האור שלהם 7, ושניהם המבוגרים והביצים רגישות מקצבי יממת 8, כך להשגת התוצאות הטובות ביותר את תהליך ההזרעה המלאכותי אמור להתרחש בתוך פרק זמן זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים
זה קריטי לעבוד בתנאים של יעיל הפריה חוץ גופית. כדי להבטיח אספקה טובה של ביציות בשלות (שלב 1), נקבות להגדיר עבור הזדווגות לא היה צריך להגדיר ב צלבי הזדווגות במשך 5 ימים לפחות, והיא אמורה להופיע הרה. במהלך ההפרעה של רבי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.
Materials
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 5 | see above | see above | 1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4°C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
- Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
- Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
- Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. . The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).
- Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
- Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
- Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).
- Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
- Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
- Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
- Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank’s saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
- Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
- Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
- Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
- Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. . Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).
