Плоидность Манипуляция эмбрионов данио рерио с теплового шока 2 Лечение

Этот протокол позволяет манипулировать плоидности у эмбрионов данио рерио, таких , как в поколении гомозиготных гиногенетических диплоидами из гиногенетических гаплоидов (рисунок 1) или для производства тетраплоидов. Это достигается за счет индукции задержки в цитокинеза , соответствующей точности одного клеточного цикла (фиг 2А, 2В). Ключом задержка в один цикл в цитокинезе достигается путем обработки теплового шока. Стандартный протокол теплового шока (HS), первоначально описанной Streisinger и его коллеги участвуют импульс температуры в течение периода 13-15 МПФ, в результате чего один цикл клеточного деления киоска в течение первого клеточного цикла ^1. Эффективность данного протокола была недавно улучшена путем сканирования ранних клеточных циклов с выдвижным временного окна теплового шока лечения. Это сканирование определили более поздний момент времени для теплового шока, до сих пор в течение первого клеточного цикла (22-24 MPF), что приводит к более высокой скорости EMBRYos с деления клетки стойло на один такт, что в данном случае не влияет на вторую клеточный цикл ^2. Наблюдение , что экспериментальные манипуляции во время первого клеточного цикла мешают деления клеток во время второго клеточного цикла и привести к ДНК дублирования контента также сообщалось в других видов рыб ^3,4. Мы имеем в виду этого модифицированного протокола в качестве теплового шока 2 (HS2 – термин "2" отражает, что тепловой импульс происходит в более поздний момент времени, чем стандартный метод HS, и что задержка клеточного цикла, вызванное HS2 происходит во время второго клеточного цикла ). Эти исследования показали, что основанием для ареста цитотомии после теплового шока является ингибирование центриолей дублирования во время теплового импульса, который влияет на формирование веретена и борозды индукции следующим клеточного цикла. Результаты HS2 с выходом остановки клеточного цикла , приближающиеся 100%, а темпы плоидности дублирования в 4 раза выше , чем стандартные HS ^2.

Эмбрионы лечение остроумиега теплового шока во время езды на велосипеде бластомеров клеток обнаруживают много вредных эффектов, предполагая , что тепловой шок влияет на несколько процессов , необходимых для клеточного деления ^2. С другой стороны, если тепловой удар наносится до начала клеточного езда на велосипеде (период времени 0-30 MPF), по- видимому, имели эффекты в соответствии с конкретным вмешательством центриолей дублирования и, кажется , не влияют на другие важные процессы в клетке ² , Эти исследования показали, что время до начала деления бластомеров, как представляется, период развития поддаются с помощью теплового шока в качестве инструмента для специфически манипулировать плоидность через центриолей торможения. Основная причина кажущейся селективности в отношении теплового шока на центриолей дублирования неизвестна, но может быть связано с селективной деградации центросомой субструктур , наблюдаемых при тепловом стрессе в определенных типах клеток, таких как лейкоциты ^5.

Временная синхронизация эмбрионального девития достигается путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Использование необработанной спермы во время оплодотворения результатов в диплоидных эмбрионов, что при HS2-индуцированных один цикл цитокинез стойло стать тетраплоид. Использование УФ – обработанной спермы, который несет сшивок , которые инактивируют ее ДНК, результаты в гиногенетических гаплоидных эмбрионов ^6, который при HSII-индуцированных один цикл цитокинез стойло стал гиногенетических Диплоиды ^2. Из-за полученного целого генома дублирования, последний гиногенетических Диплоиды являются гомозиготными в каждом локусе через геном. Для краткости, мы имеем в виду гиногенетических гаплоидные эмбрионы как "гаплоидов", и гомозиготных гиногенетических диплоидных эмбрионов, как "гомозиготных диплоидами". Если жизнеспособной и плодородные, гомозиготные Диплоиды могут быть использованы для инициирования стерильных и летальные свободных линий. Прямой гомозиготность, индуцированный HS2 также должны быть легко включены в генетический анализ или генетических экранов, так как гомозиготных диплоидами от самок, которые являются гетерозиготными носителями Мутations ставки демонстрируют гомозиготности при высоких и фиксированной (50%). пропорции ²

Следующий протокол описывает шаги для выполнения Hs2 и индуцируют плоидности дублирования с полной гомозиготности. Для тетраплоидной производства, решение спермы должно быть не лечить. Для получения гомозиготных диплоидных производства, сперма должна быть инактивированной с помощью УФ-обработки. Кроме того, как описано в дискуссии, видимые маркеры пигмента также могут быть использованы для облегчения идентификации гомозиготных диплоидами. Данио мате в основном в течение первых 3 ч от начала их светового цикла ^7, и как взрослым , так и яйца чувствительны к циркадных ритмов ^8, так что для достижения наилучших результатов процедура ЭКО должно происходить в течение этого периода времени.