Summary

Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

Published: December 16, 2016
doi:

Summary

Un protocole modifié pour la manipulation ploïdie utilise un choc thermique pour induire un décrochage d'un cycle cytokinèse dans l'embryon précoce. Ce protocole est mise en évidence chez le poisson zèbre, mais il peut être applicable à d'autres espèces.

Abstract

Manipulation de ploïdie permet de transformations utiles, telles que les diploïdes à tétraploïdes ou haploïdes à diploïdes. Dans le Danio rerio zebrafish, en particulier la génération de diploïdes homozygotes gynogénétiques est utile dans l' analyse génétique , car elle permet la production directe d'homozygotes à partir d' une seule mère hétérozygote. Cet article décrit un protocole modifié pour ploïdie duplication basée sur une impulsion de chaleur au cours du premier cycle cellulaire, Heat Shock 2 (HS2). Grâce à l'inhibition de la duplication centriole, cette méthode se traduit par une division cellulaire précise décrochage au cours du deuxième cycle cellulaire. La précision d'un cycle de division décrochage, couplé à pas affecté duplication d'ADN, se traduit par la duplication du génome entier. Protocoles associés à cette méthode comprennent l' oeuf et la collecte de sperme, traitement UV des spermatozoïdes, la fécondation in vitro et le pouls de la chaleur pour provoquer une division d' une cellule de cycle retard et la duplication ploïdie. Une version modifiée de ce protocole peut être appliquépour induire des changements de ploïdie chez d'autres espèces animales.

Introduction

Ce protocole permet la manipulation des embryons de poisson zèbre dans la ploïdie, tels que la génération de diploïdes gynogénétiques homozygotes à partir haploïdes gynogénétiques (figure 1) ou la production de tétraploïdes. Ceci est réalisé en induisant un retard dans la cytocinèse correspondant exactement à un cycle cellulaire (figure 2A, 2B). Le retard touche un cycle cytokinèse est obtenu par le traitement par choc thermique. Le protocole standard de choc thermique (HS) tel que décrit à l' origine par Streisinger et ses collègues impliqués une impulsion de température au cours de la période mpf 13-15, résultant en une un cycle de la division cellulaire décrochage au cours du premier cycle cellulaire 1. L'efficacité de ce protocole a été récemment améliorée par balayage des cycles cellulaires début d'une fenêtre temporelle de glissement du traitement par choc thermique. Cette analyse a identifié un point de temps plus tard pour un choc thermique, toujours dans le premier cycle cellulaire (22-24 mpf), qui se traduit par un taux de embr supérieuryos avec un cycle de division cellulaire décrochage, qui dans ce cas affecte le second cycle cellulaire 2. L'observation selon laquelle des manipulations expérimentales pendant le premier cycle cellulaire interfèrent avec la division cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire et provoquer la duplication de l' ADN contenu a également été rapporté dans d' autres espèces de poisson 3,4. Nous nous référons à ce protocole modifié comme Heat Shock 2 (HS2 – le terme «2» signifie que l'impulsion de chaleur se produit à un moment ultérieur de la méthode de HS standard, et que le retard du cycle cellulaire causé par HS2 se produit au cours du deuxième cycle cellulaire ). Ces études ont montré que la base de la cytokinèse arrestation après un choc thermique est l'inhibition de la duplication centriole pendant l'impulsion de chaleur, ce qui affecte la formation du fuseau et de l'induction sillon dans le cycle cellulaire suivant. Résultats HS2 des rendements de l' arrêt du cycle cellulaire approchant les 100%, et les taux de ploïdie duplication jusqu'à 4 fois plus élevé que la norme HS 2.

wit Embryons traitésha choc thermique au cours blastomère cycle cellulaire présentent de nombreux effets délétères, ce qui suggère que le choc thermique affecte plusieurs processus nécessaires à la division cellulaire 2. D'autre part, si le choc thermique est appliqué avant le début du cycle cellulaire (période de temps 0-30 mpf), il semble avoir des effets cohérents avec l' interférence spécifique avec la duplication centriole et ne semble pas affecter d' autres processus cellulaires essentiels 2 . Ces études ont montré que le temps avant le début de la division blastomère semble être une période de développement prête à l'utilisation de choc thermique comme un outil pour manipuler spécifiquement ploïdie par inhibition centriole. La cause sous – jacente de la sélectivité apparente pour le choc thermique sur la duplication centriole est inconnue, mais peut être liée à une dégradation sélective des structures centrosome observées sous contrainte thermique dans certains types de cellules, telles que les leucocytes 5.

synchronisation temporelle de l'embryon dedéveloppement est réalisé par la fécondation in vitro (FIV). Utilisation du sperme non traité au cours des résultats de fécondation chez les embryons diploïdes que lors de HS2-induits d'un cycle cytokinesis décrochage se tétraploïde. Utilisation des traités-UV sperme, qui porte réticulations qui inactivent son ADN, les résultats dans les embryons haploïdes gynogénétiques 6, qui , après HSII induite par un cycle cytokinesis décrochage devenir diploïdes gynogénétiques 2. En raison de la duplication du génome entier résultant, ce dernier diploïdes gynogénétiques sont homozygotes à chaque locus unique à travers le génome. Pour la concision, nous nous référons à gynogénétiques embryons haploïdes comme «haploïdes», et les embryons diploïdes homozygotes gynogénétiques que "diploïdes homozygotes". Si viables et fertiles, les diploïdes homozygotes peuvent être utilisés pour initier des lignes stériles et létaux-libre. homozygotie directe induite par HS2 devrait également être facilement incorporé dans l'analyse génétique ou écrans génétiques, depuis diploïdes homozygotes des femelles qui sont porteurs hétérozygotes de mutations taux d'exposition de homozygotie à (50%) 2 ratios élevés et fixes.

Le protocole suivant décrit les étapes à effectuer HS2 et induire la duplication ploïdie en pleine homozygotie. Pour la production tétraploïde, solution de sperme doit être traitée. Pour la production diploïdes homozygotes, le sperme doit être inactivé par traitement UV. En outre, comme il est décrit dans l'analyse, des marqueurs de pigment visible peuvent également être utilisés pour faciliter l'identification des diploïdes homozygotes. Compagnon Zebrafish principalement durant les 3 premières heures de l'ouverture de leur cycle de lumière 7, et les deux adultes et les œufs sont sensibles aux rythmes circadiens 8, donc pour obtenir les meilleurs résultats de la procédure de FIV devrait avoir lieu dans cette période de temps.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été réalisées selon l'Université du Wisconsin – Madison et institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices (Université du Wisconsin – Madison Numéro d'assurance A3368-01). 1. Sélection de femelles pour la collecte des oeufs via Mating Interrupted REMARQUE: des protocoles basés sur FIV reposent sur l'extrusion d'oeufs matures à partir des femelles par pression manuelle 9. protoco…

Representative Results

En dépit de l'une des cellules cytokinèse du cycle de décrochage, la replication de l' ADN se produit normalement dans ces embryons, ce qui entraîne la duplication du contenu d'ADN de l'embryon (figure 1). Le protocole Streisinger Heat Shock (standard HS) implique une impulsion de chaleur au cours de la période 13-15 minutes après la fécondation (MPF) et induit principalement cytokinesis arrestation au cours de la première division cellulaire embr…

Discussion

Les étapes critiques

Il est essentiel de travailler dans des conditions d'efficacité dans la fécondation in vitro. Pour assurer un bon approvisionnement d'oeufs matures (étape 1), les femelles mis en place pour l'accouplement ne doivent pas avoir été mis en place dans les croisements d'accouplement pendant au moins 5 jours et devrait apparaître gravide. Pendant l'interruption de la reproduction, un observateur peut surveiller 15-30 réservoirs de manière adéquate po…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Materials

Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5 see above see above 1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

References

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Cite This Article
Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

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