Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Ces dernières années , il y a eu une impulsion significative placé sur la conception des cultures transgéniques pour surmonter diverses maladies ^1, conférer une résistance aux herbicides ^2, confère la sécheresse ^3,4 et la tolérance au sel ^5, prévenir herbivory ^6, augmenter le rendement de la biomasse ^7, et de diminuer la paroi cellulaire récalcitrante ^8. Cette tendance a été favorisée par le développement de nouveaux outils moléculaires pour générer des plantes transgéniques, y compris le génome d'édition en utilisant CRISPR et TALENs ⁹ et silençage génique par ARNdb ^10, miRNA ¹¹ et siRNA ^12. Bien que ces technologies ont simplifié la génération de plantes transgéniques, ils ont également créé un goulot d'étranglement, où le grand nombre de plantes transgéniques générées ne peuvent pas être criblée en utilisant les systèmes traditionnels qui reposent sur la régénération des plantes. Associés à ce goulot d'étranglement, tout en réduisant au silence et génome édition constructions peuvent être insérés rapidement dans les plantes, un grand nombre detraits ciblés ne parviennent pas à produire l'effet désiré, qui est souvent découverte que les plantes sont analysées dans la serre. Dans ce travail, nous avons développé une méthode pour rapide automatisée, le dépistage, à haut débit de protoplastes végétaux, en particulier pour résoudre le goulot d'étranglement dans le dépistage précoce d'un grand nombre de génomes d'édition et le gène silencieux cibles.

L'utilisation de protoplastes, par opposition à des cellules végétales intactes, présente plusieurs avantages pour le développement d'une plateforme automatisée. Tout d' abord, les protoplastes sont isolés après digestion de la paroi cellulaire de la plante, et cette barrière ne présentent plus, l' efficacité de transformation ¹³ est augmentée. Dans les cellules végétales intactes il y a seulement deux méthodes bien établies pour la transformation, biolistique ¹⁴ et Agrobacterium transformation médiée ^15. Aucune de ces méthodes peuvent être facilement convertis aux plates-formes de manipulation de liquides, comme biolistique nécessite un équipement spécialisé pour transformation, alors que Agrobacterium transformation médiée nécessite co-culture et l' élimination ultérieure des bactéries. Ni se prêtent à des procédés à haut débit. Dans le cas de protoplastes, la transformation est habituellement effectuée en utilisant le polyéthylène glycol (PEG) de transfection médiée ^16, qui ne nécessite plusieurs échanges de solutions, et est idéale pour les plates – formes de manipulation de liquides. En second lieu, les protoplastes, par définition, sont des cultures monocellulaires, et donc les problèmes associés à l'agglutination et la formation chaîne dans des cultures de cellules végétales, ne sont pas observés dans les protoplastes. En termes de dépistage rapide à l'aide d'un spectrophotomètre à base de plaque, l'agglutination des cellules, ou des cellules dans plusieurs plans vont conduire à des difficultés dans l'acquisition de mesures cohérentes. Etant donné que les protoplastes sont aussi plus denses que les milieux de culture, ils sédimentent au fond du puits, la formation d'une monocouche, ce qui est favorable à la spectrophotométrie sur la base de plaque. Enfin, alors que les cultures en suspension de cellules végétales sont primarille dérivé de ¹⁷ cals, les protoplastes peuvent être récoltées à partir d' un certain nombre de tissus végétaux, conduisant à la possibilité d'identifier une expression spécifique d' un tissu. Par exemple, la capacité d'analyser root- ou une expression spécifique de feuille d'un gène peut être très important pour la prédiction du phénotype. Pour ces raisons, les protocoles mis au point dans ce travail ont été validées en utilisant des protoplastes isolés du tabac largement utilisé (Nicotiana tabacum L.) 2 (PAR-2) de culture en suspension 'Bright Yellow'.

La culture en suspension BY-2 a été décrite comme étant la cellule "Hela" des plantes supérieures, en raison de son utilisation généralisée dans l' analyse moléculaire des cellules végétales ^18. Récemment, PAR-2 cellules ont été utilisées pour étudier les effets de facteurs de stress plante ^19-22, protéine intracellulaire localisation ^23,24, et la biologie cellulaire de base ^25-27 démontrant l'utilité générale de ces cultures en biologie végétale. Un avantage supplémentaire de BY-2 est la culturepossibilité de synchroniser les cultures avec aphidicoline, ce qui peut conduire à une meilleure reproductibilité pour l' expression génique des études ^28. En outre, des méthodes ont été mises au point pour l'extraction de PAR-2 protoplastes utilisant des enzymes à faible coût ^29,30, comme enzymes traditionnellement utilisées pour générer des protoplastes sont des coûts prohibitifs pour les systèmes à haut débit. En tant que tel, le protocole décrit ci-dessous a été validé en utilisant la culture en suspension BY-2, mais il devrait être amendable à une culture usine de suspension cellulaire. Les expériences de validation de concept sont effectuées en utilisant une protéine de fluorescence orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) des Porites de coraux durs porites ³¹ sous le contrôle du promoteur CAMV 35S.