Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Negli ultimi anni vi è stato significativo impulso posto sulla progettazione delle colture transgeniche per superare le varie malattie ^1, dotare resistenza agli erbicidi ^2, conferiscono alla siccità e ^3,4 tolleranza al sale ^5, prevenire erbivori ^6, aumento della biomassa resa ^7, e diminuire recalcitrance parete cellulare ^8. Questa tendenza è stata aiutata dallo sviluppo di nuovi strumenti molecolari per la generazione di piante transgeniche, tra cui genoma di modifica utilizzando CRISPR e Talens ^9, e silenziamento genico attraverso dsRNA ^10, miRNA ^11, e siRNA ^12. Mentre queste tecnologie hanno semplificato la generazione di piante transgeniche, hanno anche creato un collo di bottiglia, dove il gran numero di piante transgeniche generate non possono essere sottoposti a screening con sistemi tradizionali che si basano sulla rigenerazione delle piante. In relazione a questo collo di bottiglia, mentre il silenziamento e del genoma di modifica costrutti possono essere rapidamente inseriti nelle piante, molte delletratti mirati riescono a produrre l'effetto desiderato, che spesso non è scoperto fino piante sono analizzati nella serra. In questo lavoro, abbiamo messo a punto un metodo per la rapida automatizzato, lo screening, high-throughput di protoplasti vegetali, in particolare per affrontare il collo di bottiglia attuale screening precoce di un gran numero di genoma-editing e silenziamento genico obiettivi.

L'uso di protoplasti, al contrario di cellule vegetali intatte, ha diversi vantaggi per lo sviluppo di una piattaforma automatizzata. Innanzitutto, protoplasti sono isolati dopo la digestione della parete cellulare, e questo non è più presente barriera, efficienza di trasformazione è aumentato ^13. In cellule vegetali intatte ci sono solo due metodi consolidati per la trasformazione, biolistics ¹⁴ e Agrobacterium mediata trasformazione ^15. Nessuno di questi metodi può essere facilmente tradotto per piattaforme gestione di liquidi, come biolistics richiede attrezzature specializzate per Transformazioni, mentre Agrobacterium trasformazione mediata richiede co-cultura e la successiva rimozione dei batteri. Né sono suscettibili di metodi di high throughput. Nel caso di protoplasti, trasformazione viene normalmente condotta utilizzando polietilene glicole (PEG) trasfezione mediata ^16, che richiede solo alcuni scambi soluzione, ed è particolarmente adatto per le piattaforme gestione dei liquidi. In secondo luogo, protoplasti, per definizione, sono culture monocellulari e quindi i problemi associati con formazione di grumi e catena di formazione in colture cellulari vegetali, non sono osservati in protoplasti. In termini di screening rapido utilizzando uno spettrofotometro piatto a base di aggregazione delle cellule, o cellule in piani multipli porterà a difficoltà di acquisire misurazioni coerenti. Poiché protoplasti sono anche più densa loro terreni di coltura, essi sedimentare sul fondo dei pozzetti, formando un monostrato, che è favorevole per spettrofotometria piastra base. Infine, mentre colture in sospensione di cellule vegetali sono Primarily derivati da callo ^17, protoplasti possono essere raccolte da un certo numero di tessuti vegetali, portando alla capacità di identificare l'espressione tessuto-specifica. Ad esempio, la capacità di analizzare root- o-specifico espressione foglia di un gene può essere molto importante fenotipo previsione. Per queste ragioni, i protocolli sviluppati in questo lavoro sono stati convalidati usando protoplasti isolati dal tabacco diffuso (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) cultura sospensione.

La coltura in sospensione BY-2 è stato descritto come la cella "HeLa" di piante superiori, grazie al suo uso diffuso in analisi molecolare di cellule vegetali ^18. Recentemente, BY-2 le cellule sono state usate per studiare gli effetti delle piante di stress ^19-22, la localizzazione della proteina intracellulare ^23,24, e biologia cellulare di base ^25-27 dimostrare l'ampio programma di utilità di queste culture in biologia vegetale. Un ulteriore vantaggio di BY-2 culture è ilpossibilità di sincronizzare le culture con afidicolina, che può portare ad una maggiore riproducibilità per l'espressione genica studia ^28. Inoltre, sono stati sviluppati metodi per l'estrazione di BY-2 protoplasti utilizzando enzimi basso costo ^29,30, come enzimi tradizionalmente utilizzati per generare protoplasti sono costi proibitivi per i sistemi ad elevata capacità. Come tale, il protocollo descritto di seguito è stato convalidato utilizzando la coltura in sospensione BY-2, ma dovrebbe essere modificabile a qualsiasi coltura in sospensione delle cellule vegetali. Proof-of-concept esperimenti vengono eseguiti utilizzando un arancio proteina a fluorescenza (OFP) gene reporter (pporRFP) dalle Porites di corallo duro Porites ³¹ sotto il controllo del promotore CaMV 35S.