Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

In den letzten Jahren hat es erhebliche Impulse auf die Gestaltung von transgenen Kulturen gelegt worden , um verschiedene Krankheiten ^1, verleihen Herbizidresistenz ^2, verleihen Dürre ^3,4 und Salztoleranz ^5, verhindern Herbivorie ^6, erhöhen Biomasseertrag ⁷ und verringern Zellwand Widerspenstigkeit überwinden ^8. Dieser Trend wurde durch die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge zur Erzeugung transgener Pflanzen Aided, einschließlich Genom-Bearbeitung mit CRISPR und Talens ⁹ und Gen durch dsRNA – Silencing ^10, miRNA ¹¹ und siRNA ^12. Während diese Technologien die Erzeugung transgener Pflanzen vereinfacht haben, haben sie erstellt auch einen Engpass, wo die schiere Anzahl der transgenen Pflanzen erzeugt wird, nicht traditionellen Systemen mit gescreent werden, die auf die Pflanzenregeneration verlassen. Im Zusammenhang mit diesem Engpass, während zum Schweigen zu bringen und Genom-Editing-Konstrukte schnell in Pflanzen eingeführt werden kann, sind viele dergezielte Züge nicht den gewünschten Effekt zu erzeugen, die oft erst entdeckt, wenn Pflanzen im Gewächshaus analysiert werden. In dieser Arbeit haben wir ein Verfahren zur schnellen, automatisierten Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenprotoplasten entwickelt, die speziell den aktuellen Engpass in der frühen Screening einer großen Anzahl von Genombearbeitung und Gen-Silencing Ziele zu adressieren.

Die Verwendung von Protoplasten zu intakten Pflanzenzellen gegenüber, hat mehrere Vorteile für die Entwicklung eines automatisierten Plattform. Zuerst Protoplasten werden aber nach Aufschluss der Pflanzenzellwand isoliert und mit dieser Barriere nicht mehr vorhanden ist , wird die Transformationseffizienz ¹³ erhöht. In intakten Pflanzenzellen gibt es nur zwei etablierte Methoden zur Transformation, Biolistik ¹⁴ und Agrobacterium -vermittelte Transformation ^15. Keines dieser Verfahren kann leicht an Liquid-Handling-Plattformen übersetzt werden, wie Biolistik erfordert spezielle Ausrüstung für transformation, während Agrobacterium -vermittelte Transformation erfordert Kokultur und anschließende Entfernung der Bakterien. Weder sind zugänglich für Hochdurchsatzverfahren. Im Falle von Protoplasten wird routinemßig Transformations ^16, unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) -vermittelte Transfektion durchgeführt , die nur mehrere Lösungs Austausch erfordert, und ist ideal für Liquid – Handling – Plattformen geeignet. Zweitens, Protoplasten, per Definition, Single-Zellkulturen sind, und damit die mit Verklumpung und Kettenbildung verbundenen Probleme in pflanzlichen Zellkulturen, die nicht in Protoplasten beobachtet. Im Hinblick auf die schnelle Screening eine plattenbasierte Spektrophotometer, Verklumpung von Zellen, oder Zellen in mehreren Ebenen werden in den Erwerb konsistente Messungen zu Schwierigkeiten führen. Da Protoplasten auch dichter ist als die Kulturmedien sind, sedimentieren sie auf den Boden des Wells, um eine Monoschicht bilden, die für plattenbasierte Spektrophotometrie förderlich ist. Schließlich, während Pflanzenzellkulturen sind primarily aus Kallus ¹⁷ abgeleitet, Protoplasten können aus einer Anzahl von Pflanzengeweben geerntet werden, zu der Fähigkeit führt die gewebespezifische Expression zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Fähigkeit, Wurzel- oder blattspezifische Expression eines Gens kann sehr wichtig sein, um Phänotyp Vorhersage zu analysieren. Aus diesen Gründen sind die in dieser Arbeit entwickelten Protokolle wurden validiert Protoplasten isoliert von der weit verbreiteten Tabak (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Suspensionskultur mit.

Die BY-2 – Suspensionskultur wurde als "HeLa" Zelle von höheren Pflanzen beschrieben worden ist , wegen seiner allgegenwärtigen Einsatz in der molekularen Analyse von Pflanzenzellen ^18. Kürzlich wurden BY-2 – Zellen verwendet , um die Effekte der Pflanze zu untersuchen Stressoren ^19-22, intrazelluläre Proteinlokalisation ^23,24 und Grund Zellbiologie ^25-27 der breiten Verwendbarkeit dieser Kulturen in Pflanzenbiologie demonstriert. Ein zusätzlicher Vorteil der BY-2 Kulturen ist dieFähigkeit , die Kulturen mit Aphidicolin zu synchronisieren, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit für Genexpressionsstudien führen kann ^28. Darüber hinaus wurden für die Extraktion von BY-2 – Protoplasten unter Verwendung von Low-Cost – Enzyme ^29,30, als Enzyme traditionell verwendet zur Erzeugung von Protoplasten sind unerschwinglich für Hochdurchsatz – Systeme Methoden entwickelt. Als solches beschriebene Protokoll unter validiert wurde die BY-2-Suspensionskultur verwendet, aber es sollte auf jede Pflanzenzellsuspensionskultur abänderbar ist. Proof-of-Concept – Experimente werden mit einem Orange – Fluoreszenz – Protein (OFP) Reporter – Gen (pporRFP) von den Hartkorallen Porites ausgeführt Porites- ³¹ unter der Kontrolle des CaMV 35S – Promotors.