Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

В последние годы наблюдается значительный импульс уделяется разработке трансгенных культур для преодоления различных заболеваний ^1, наделяют устойчивость к гербицидам ^2, придают засуху ^3,4 и солеустойчивости ^5, предотвратить herbivory ^6, увеличить выход биомассы ^7, и уменьшение клеточной стенки упрямство ^8. Эта тенденция способствовала развитию новых молекулярных инструментов для создания трансгенных растений, в том числе генома редактирования с использованием CRISPR и Таленс ⁹ и молчанием генов через дсРНК ^10, микроРНК ¹¹ и миРНК ^12. Несмотря на то, что эти технологии упростили поколение трансгенных растений, они также создали узкое место, где огромное количество трансгенных растений, генерируемый не могут быть подвергнуты скринингу с использованием традиционных систем, которые полагаются на регенерации растений. В связи с этим узким местом, в то время как глушителей и геном-редактирования конструкции могут быть быстро вставлены в растения, многие изцелевые черты не производят желаемого эффекта, который часто не обнаружен, пока растения не анализируются в теплице. В этой работе, мы разработали метод для быстрого, автоматизированного, высокопроизводительного скрининга растительных протопластов, специально для решения текущего узкого места в начале скрининга большого количества генома-редактирования и молчанием генов мишеней.

Использование протопластов, в отличие от интактных клеток растений, имеет ряд преимуществ для разработки автоматизированной платформы. Во- первых, Протопласты были выделены после переваривания клеточной стенки растений, и с этим барьером больше нет, эффективность преобразования повышается ^13. В интактных клетках растений существуют только два хорошо известных методов трансформации, биолистики ¹⁴ и Agrobacterium опосредованной трансформации ^15. Ни один из этих методов могут быть легко переведены на жидких погрузочно-платформ, так как биолистики требует специального оборудования для Трансформатория, в то время как Agrobacterium -опосредованного преобразование требует совместной культуре и последующее удаление бактерий. Ни один не поддаются для высоких методов пропускной способности. В случае протопластов, преобразование обычно проводят с использованием полиэтиленгликоля (PEG) -опосредованного трансфекцию ^16, которая требует только несколько обменов решения, и идеально подходит для жидких обработки платформ. Во-вторых, протопласты, по определению, являются одноклеточные культуры, и, таким образом, проблемы, связанные с слипания и цепи формирования в растительных клеточных культурах, не наблюдаются в протопласты. С точки зрения быстрого скрининга с использованием планшетов на основе спектрофотометра, слипание клеток, или клетки в нескольких плоскостях, приведет к трудности в получении устойчивых результатов измерений. Так как протопласты также более плотной, чем их культуральных сред, они оседают на дно лунок, образуя монослой, которая благоприятна для плиты на основе спектрофотометрии. И, наконец, в то время как клетки растения суспензионные культуры являются примарILY полученный из каллуса ^17, протопласты могут быть собраны из ряда тканей растений, что приводит к возможности идентификации экспрессии тканеспецифической. Например, возможность анализа или листа: корневой-специфическую экспрессию гена, может быть очень важным для прогнозирования фенотипа. По этим причинам, протоколы , разработанные в этой работе были проверены с использованием протопластов , выделенных из широко используемых табака (Nicotiana аЬасит L.) 'Ярко – желтый' 2 (BY-2) суспензионную культуру.

Побочный 2 суспензионной культуры была описана как "HeLa" клетки высших растений, из – за его повсеместной использования в молекулярном анализе растительных клеток ^18. В последнее время BY-2 клетки были использованы для изучения влияния основных стрессоров ^19-22, локализация внутриклеточный белок ^23,24, и основной клеточной биологии ^25-27 демонстрируют широкой полезности этих культур в биологии растений. Дополнительное преимущество × 2 культур являетсявозможность синхронизации культур с aphidicolin, что может привести к повышению воспроизводимости для экспрессии гена исследования ^28. Кроме того, были разработаны методы для извлечения BY-2 протопласты с использованием недорогих ферментов ^29,30, так как ферменты , традиционно используемые для формирования протопластов являются экономически запретительной для систем с высокой пропускной способностью . Таким образом, протокол, описанный ниже, была проверена с использованием суспензионного культуры BY-2, но оно должно быть исправимо к любой клеточной суспензии растений культуры. Доказательство концептуальных экспериментов проводили с использованием оранжевого флуоресцентного белка (ОФП) ген – репортер (pporRFP) из твердых кораллов Porites Porites ³¹ под контролем промотора CaMV 35S.