A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Nos últimos anos tem havido um impulso significativo colocado sobre a concepção de culturas transgênicas para superar várias doenças ^1, dotar resistência a herbicida ^2, conferem seca ^3,4 e tolerância ao sal ^5, evitar herbivoria ^6, aumentar a produção de biomassa ^7, e diminuir a recalcitrância da parede celular ^8. Esta tendência foi ajudada pelo desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para a geração de plantas transgénicas, incluindo genoma de edição utilizando CRISPR e TALENS ^9, e silenciamento de genes por meio de ARNcd ^{de 10, 11} miARN, e ARNsi ^12. Embora estas tecnologias simplificaram a geração de plantas transgênicas, eles também criaram um gargalo, onde o grande número de plantas transgénicas gerada não podem ser rastreados usando sistemas tradicionais que dependem de regeneração de plantas. Relacionado com este gargalo, enquanto que o silenciamento e de edição de genoma construções podem ser rapidamente inserido em plantas, muitos doscaracterísticas visadas não conseguem produzir o efeito desejado, o que muitas vezes não é descoberto até que as plantas são analisados ​​na estufa. Neste trabalho, nós desenvolvemos um método para o rápido rastreio automatizado, de alto rendimento de protoplastos de plantas, especificamente para lidar com o gargalo de corrente no rastreio inicial de um grande número de genoma de edição e silenciamento de genes alvos.

O uso de protoplastos, em oposição às células de plantas intactas, tem várias vantagens para o desenvolvimento de uma plataforma automatizada. Em primeiro lugar, os protoplastos são isolados após a digestão da parede celular de plantas, e com isso já não presente barreira, a eficiência de transformação é aumentada ^13. Nas células vegetais intactas há apenas dois métodos bem estabelecidos para a transformação biolística, ¹⁴ e ^{15 de} transformação mediada por Agrobacterium. Nenhum desses métodos podem ser facilmente convertidos para plataformas de manipulação de líquidos, como biolistics exige equipamento especializado para transformação, enquanto transformação mediada por Agrobacterium requer a co-cultura e a subsequente remoção das bactérias. Nem são passíveis de métodos de alto rendimento. No caso de protoplastos, a transformação é realizada rotineiramente utilizando polietileno-glicol (PEG) a transfecção mediada por ^16, que só requer várias trocas de solução, e é especialmente adequado para plataformas de manipulação de líquidos. Em segundo lugar, os protoplastos, por definição, são as culturas de uma única célula, e assim os problemas associados com a acumulação e a formação da cadeia em culturas de células de plantas, não são observados em protoplastos. Em termos de rastreio rápida utilizando um espectrofotómetro de placa-base, a aglutinação de células, ou células em planos múltiplos irá conduzir a dificuldade em adquirir medições consistentes. Uma vez que os protoplastos são também mais denso do que o seu meio de cultura, eles sedimentar para o fundo dos poços, a formação de uma monocamada, o que é favorável para espectrofotometria à base de chapa. Finalmente, enquanto que as culturas em suspensão de células de plantas são Primarily derivado do calo ^17, os protoplastos podem ser colhidas a partir de uma série de tecidos de plantas, conduzindo-se à capacidade para identificar a expressão específica de tecido. Por exemplo, a capacidade de analisar raiz- ou expressão específica de folha de um gene pode ser muito importante para a predição fenótipo. Por estas razões, os protocolos desenvolvidos neste trabalho foram validados utilizando protoplastos isolados do tabaco amplamente utilizado (Nicotiana tabacum L.) cultura em suspensão "amarelo brilhante" 2 (BY-2).

A cultura em suspensão BY-2 foi descrito como a célula "HeLa" de plantas superiores, devido ao seu uso disseminado em análise molecular de células de plantas ^18. Recentemente, BY-2 de células têm sido usadas para estudar os efeitos da planta estressores ^19-22, localização da proteína intracelular ^23,24, biologia celular e de base ^25-27 demonstrando a ampla utilidade destas culturas na biologia das plantas. Uma vantagem adicional de a-2 é a culturascapacidade para sincronizar as culturas com afidicolina, que pode levar a reprodutibilidade melhorada para a expressão do gene ²⁸ estuda. Além disso, têm sido desenvolvidos métodos para a extracção de 2-POR protoplastos utilizando enzimas de baixo custo ^29,30, como as enzimas utilizadas tradicionalmente para gerar protoplastos são de custo proibitivo para sistemas de alto rendimento. Como tal, o protocolo descrito abaixo foi validado usando a cultura em suspensão BY-2, mas deve ser modificável com qualquer cultura em suspensão de células de plantas. Experimentos de prova de conceito são realizadas utilizando um gene repórter da proteína de fluorescência laranja (OFP) (pporRFP) a partir dos Porites de coral Porites rígidos ³¹ sob o controlo do promotor CaMV 35S.