Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

In de afgelopen jaren is er een belangrijke impuls gelegd aan het ontwerp van transgene gewassen voor verschillende ziekten ¹ te overwinnen, schenken herbicide weerstand ^2, overleggen droogte ^3,4 en zouttolerantie ⁵ geweest, herbivorie ⁶ te voorkomen, te verhogen biomassaopbrengst ⁷ en celwand weerspannigheid verlagen ^8. Deze trend is geholpen door de ontwikkeling van nieuwe moleculaire technieken voor het genereren van transgene planten, waaronder genoom-bewerk, CRISPR Talens en ^9, en silencing tot dsRNA ^{10, 11} miRNA en siRNA ^12. Hoewel deze technologieën het genereren van transgene planten hebben vereenvoudigd, hebben ze ook een bottleneck, waarbij het grote aantal transgene planten gegenereerd kunnen niet worden gescreend met behulp van traditionele systemen die afhankelijk zijn van planten regeneratie. Voor dit knelpunt, terwijl zwijgen en genoom-editing constructen kunnen snel in planten worden ingebracht, velegerichte eigenschappen niet het gewenste effect, die vaak niet ontdekt tot planten worden geanalyseerd in de kas te produceren. In dit werk hebben we een werkwijze voor snelle, geautomatiseerde high-throughput screening van plantenprotoplasten ontwikkeld, specifiek de huidige bottleneck begin screening van grote aantallen genoom-editing en silencing streefwaarden.

Het gebruik van protoplasten, in tegenstelling tot intacte plantencellen, heeft een aantal voordelen voor de ontwikkeling van een geautomatiseerd platform. Eerst worden protoplasten geïsoleerd na digestie van de plantencelwand, en deze barrière niet meer aanwezig, wordt transformatie-efficiëntie verhoogd ^13. In intacte plantencellen zijn er slechts twee gevestigde methoden voor transformatie, biolistica ¹⁴ en Agrobacterium-gemedieerde transformatie ^15. Geen van deze methoden kan gemakkelijk worden vertaald naar liquid handling platforms, zoals biolistica vereist gespecialiseerde apparatuur voor transformatie, terwijl Agrobacterium-gemedieerde transformatie vereist co-cultuur en de daarop volgende verwijdering van de bacteriën. Niet vatbaar voor high throughput methode. Bij protoplasten, transformatie wordt routinematig uitgevoerd met polyethyleenglycol (PEG) bemiddelde transfectie ^16, die op verschillende oplossing vereist uitwisseling, en is ideaal voor vloeistofverwerking platforms. Anderzijds protoplasten per definitie zijn eencellige kweken, en dus de problemen van klontering en ketenvorming in plantencelkweken, worden niet waargenomen in protoplasten. In termen van een snelle screening met behulp van een plaat gebaseerde spectrofotometer, samenklontering van cellen, of cellen in meerdere vlakken zal leiden tot moeilijkheden bij het verkrijgen van consistente metingen. Aangezien protoplasten ook dichter dan de kweekmedia ze bezinken op de bodem van putjes, waarbij een monolaag, die bevorderlijk is voor platen gebaseerde spectrofotometrie. Tot slot, terwijl de fabriek celsuspensieculturen zijn primarily afgeleid van callus ^17, kunnen protoplasten worden verzameld van verschillende plantenweefsels, waardoor de mogelijkheid om weefselspecifieke expressie te identificeren. Bijvoorbeeld, het vermogen om wortel- of blad-specifieke expressie van een gen te analyseren kan zeer belangrijk fenotype te voorspellen. Daarom werden de die in dit werk protocollen gevalideerd middels protoplasten geïsoleerd uit de veel gebruikte tabak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow '2 (BY-2) suspensiekweek.

Het BY-2 suspensiekweek is beschreven als het "HeLa" cel van hogere planten door zijn alomtegenwoordige gebruik in moleculaire analyse van ¹⁸ plantencellen. Onlangs BY-2 cellen werden gebruikt om de effecten te bestuderen van plantaardige stressoren ^19-22, intracellulair eiwit lokalisatie ^23,24 en fundamentele celbiologie ^25-27 tonen de brede bruikbaarheid van deze culturen in plantenbiologie. Een bijkomend voordeel van BY-2 culturen demogelijkheid om de kweken te synchroniseren met aphidicoline, wat kan leiden tot verbeterde reproduceerbaarheid genexpressiestudies ^28. Bovendien zijn werkwijzen ontwikkeld voor de extractie van BY-2 protoplasten met behulp van goedkope enzymen ^29,30, enzymen traditioneel gebruikt voor het genereren van protoplasten onbetaalbaar voor high-throughput systemen. Als zodanig heeft de hieronder beschreven protocol gevalideerd met de door-2 suspensiekweek, maar het moet geamendeerd om alle planten celsuspensie cultuur. Proof-of-concept experimenten uitgevoerd met een fluorescentie eiwit (OFP) reportergen (pporRFP) vanaf het harde koraal Porites Porites ³¹ onder de controle van de CaMV35S-promoter.