ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

في السنوات الأخيرة كان هناك زخم كبير وضعت على تصميم المحاصيل المعدلة وراثيا للتغلب على الأمراض المختلفة ^1، منح مقاومة مبيدات الأعشاب ^2، منح الجفاف ^3،4 والتسامح الملح ^5، ومنع الحيوانات العاشبة ^6، وزيادة العائد الكتلة الحيوية ^7، وتقليل جدار الخلية عناد ^8. وقد ساعد هذا الاتجاه من خلال تطوير أدوات جزيئية جديدة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الجينوم التحرير باستخدام كريسبر وTALENs ^9، والجينات إسكات من خلال الرنا المزدوج الجديلة ^10، ميرنا ^11، وسيرنا ^12. في حين أن هذه التقنيات وتبسيط جيل من النباتات المعدلة وراثيا، أنها خلقت أيضا عنق الزجاجة، حيث ولدت العدد الهائل من النباتات المعدلة وراثيا لا يمكن عرضه باستخدام الأنظمة التقليدية التي تعتمد على تجديد مصنع. تتعلق هذه العقبة، في حين إسكات ويبني الجينوم التحرير يمكن إدراج بسرعة إلى النباتات، والعديد منفشلت الصفات التي تستهدف إحداث التأثير المطلوب، والتي غالبا ما تكون غير المكتشفة حتى يتم تحليل النباتات في الدفيئة. في هذا العمل، وقد وضعنا طريقة لسريع وتلقائي وفحص عالية الإنتاجية من جبلة مجردة النبات، وعلى وجه التحديد لمعالجة عنق الزجاجة الحالي في الفحص المبكر أعداد كبيرة من الجينوم التحرير والجينات إسكات الأهداف.

استخدام جبلة مجردة، بدلا من الخلايا النباتية سليمة، لديها العديد من المزايا للتطوير منصة الآلي. أولا، يتم عزل جبلة مجردة بعد هضم جدار الخلية النباتية، ومع هذا الحاجز لم تعد موجودة، وزيادة كفاءة تحويل ^13. في الخلايا النباتية سليمة لا يوجد سوى اثنين أساليب راسخة للتحول، biolistics ¹⁴ و الأجرعية التحول بوساطة ^15. أيا من هذه الأساليب يمكن ترجمتها بسهولة إلى منصات المعالجة السائلة، كما biolistics يتطلب معدات متخصصة لtransformation، في حين الأجرعية التحول بوساطة يتطلب ثقافة مشتركة وإزالة اللاحقة من البكتيريا. ولا هي قابلة لأساليب إنتاجية عالية. في حالة جبلة مجردة، يجري التحول بشكل روتيني باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ترنسفكأيشن بوساطة ^16، والتي تتطلب فقط عدة بورصات حل، ويعتبر مثاليا لمنصات المعالجة السائلة. ثانيا، جبلة مجردة، بحكم التعريف، هي ثقافات وحيدة الخلية، وبالتالي فإن المشاكل المرتبطة تشكيل تكتل وسلسلة في مزارع الخلايا النباتية، وليس لوحظ في جبلة مجردة. من حيث الفحص السريع باستخدام مقياس الطيف الضوئي، القائم على لوحة تكتل من الخلايا أو الخلايا في الطائرات متعددة سوف يؤدي إلى صعوبة في الحصول على قياسات متناسقة. منذ جبلة مجردة هي أيضا الأكثر كثافة من وسائل الاعلام ثقافتهم، والرواسب في قاع الآبار، وتشكيل أحادي الطبقة، والتي تفضي للالطيفي القائم على طبق من ذهب. وأخيرا، في حين أن الثقافات تعليق خلية النبات PRIMARالمستمدة إيلي من الكالس ^17، جبلة مجردة يمكن حصاده من عدد من الأنسجة النباتية، مما يؤدي إلى القدرة على تحديد التعبير الأنسجة محددة. على سبيل المثال، القدرة على تحليل root- أو التعبير عن ورقة محددة من الجينات يمكن أن تكون هامة جدا للتنبؤ النمط الظاهري. لهذه الأسباب، ولم يتم التحقق من البروتوكولات وضعت في هذا العمل باستخدام جبلة مجردة معزولة عن التبغ تستخدم على نطاق واسع (النيكوتين تبغ L.) "برايت صفراء '2 (BY-2) ثقافة تعليق.

وقد وصفت ثقافة تعليق BY-2 باعتبارها الخلية "هيلا" من النباتات العليا، وذلك بسبب استخدام كل مكان في التحليل الجزيئي للخلايا النبات ^18. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت خلايا BY-2 لدراسة الآثار المترتبة على مصنع الضغوطات ^19-22، داخل الخلايا البروتين توطين ^23،24، وبيولوجيا الخلية الأساسية ^25-27 يدل على فائدة واسعة من هذه الثقافات في بيولوجيا النبات. ميزة إضافية لBY-2 الثقافات هيالقدرة على مزامنة مع الثقافات aphidicolin، والتي يمكن أن تؤدي إلى تعزيز استنساخ للتعبير الجين دراسات ^28. وعلاوة على ذلك، تم تطوير طرق لاستخراج BY-2 جبلة مجردة باستخدام أنزيمات منخفضة التكلفة ^29،30، والإنزيمات التي تستخدم عادة لتوليد جبلة مجردة باهظة لأنظمة عالية الإنتاجية من حيث التكلفة. على هذا النحو، وقد تم التحقق من صحة البروتوكول هو موضح أدناه باستخدام ثقافة تعليق BY-2، ولكن يجب أن تكون قابلة للتعديل إلى أي ثقافة مصنع التعليق الخلية. وتجرى التجارب إثبات صحة مفهوم باستخدام البرتقال البروتين مضان (النفط مقابل الغذاء) مراسل الجين (pporRFP) من Porites المرجانية الصلبة porites ³¹ تحت سيطرة المروج CAMV 35S.