O uso de uma bateria de métodos químicos e ecotoxicológicos para a avaliação da eficácia dos Processos de Tratamento de Águas Residuais remover estrogénica Potência

declaração de ética: Protocolos para avaliar a desregulação do sistema endócrino atividade de substâncias / misturas em peixes foram aprovados pelo Bem-Estar Animal da Universidade de Brunel e Ética Corpo Review (AWERB) e pela UK Home Office sob os Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. 1. Água Coleta de Amostras, Preservação e Extração coleta de amostras e preservação Antes da utilização, limpar os frascos com um agente de limpeza tensio-activo adequado. Após a limpeza, lavar as garrafas com água, escorrer e secar. Recolha de amostras em frascos de vidro de capacidade de 2 L contendo um conservante consistindo em 0,5 g de cobre (II), nitrato e 6 ml de 3,6 M solução de ácido clorídrico. Armazene as amostras abaixo de 10 ° C. Extrair e analisar o mais rapidamente possível a recolha e preservação seguinte. Extração e clean-up (para análise de estrogénio esteróide) 10 Solid Phase Extraction (SPE) Antes de extração, para reduzir os sólidos em suspensão, amostras de água do filtro, utilizando 1 um papel poros do filtro tamanho. Depois filtrou-se amostras de pico com padrão interno por adição de 100 ul de solução spiking padrão interno deuterado estoque contendo 2,4,16,16-d 4 -estrone: 2,4,16,16-d 4 -17β-estradiol (E2) : e 2,4,16,16-d 4 -17α-etinilestradiol (EE2) (todos a 40 ng / L, em metanol) a 1000 ml de efluente (ou 100 ml de efluente), resultando em aumento interno de 2 ng / L para o esgoto amostras de efluentes, e 20 ng / L para amostras de esgoto afluente. Anexar forros descartáveis ​​válvulas, cartuchos SPE estireno divinil benzeno e reservatórios de cartucho para o aparelho de SPE. Ligar a bomba de vácuo para testar o equipamento está adequadamente vedado. Pipeta de 5 ml de acetato de etilo em cada reservatório, para condicionar os cartuchos. Ligar a bomba de vácuo (abaixo de 10 inHg para permitir uma taxa de fluxo inferior a 10 ml por minuto)e puxe através do líquido. Não deixe os cartuchos de SPE secar. Repita processo com 5 ml de metanol seguidos por 5 ml de água. Ateste cada reservatório do cartucho com água e ligar 1/8 "tubos de PTFE entre os reservatórios de cartucho de vidro e frascos de amostras. Ligue o vácuo, a uma taxa de fluxo inferior a 10 ml por minuto e permitir que toda a amostra a passar através do cartucho. esvazie o frasco de resíduos, se necessário. Seque bem os cartuchos SPE sob vácuo (ou usando ar ou azoto) até que o conteúdo do cartucho de mudar de cor (por exemplo, do marrom escuro ao castanho claro). Coloque frascos de 10 ml para recolha de vidro limpas e secas em rack e no interior do colector de extração. Verifique se cada forro é acima de um frasco. Pipeta 8 ml de diclorometano em cada reservatório de amostra, ligar a bomba de vácuo (taxa de fluxo inferior a 10 ml por minuto) e puxar o líquido através para dentro de frascos de recolha. Remova frascos de 10 ml do colector SPEe utilizar um concentrador para reduzir o volume de 1 ml. Transfira cada amostra em frasco de auto-amostrador e mais concentrar para 100 ul usando nitrogênio derrubar equipamento. Gel cromatografia de permeação (GPC) clean-up Injecte 95 ul do extracto de amostra eluída no HPLC equipado GPC usando as condições descritas na Tabela 1. Concentra-se o extracto até à GPC 200 mL utilizando um concentrador de azoto e soprar para baixo aparelhos e completa-se até 2,0 ml com hexano. SPE clean-up Anexar forros descartáveis ​​válvulas, cartuchos de aminopropilo e reservatórios de cartucho para o colector de SPE. Coloque frascos de 10 ml para recolha de vidro limpas e secas em rack e no interior do colector de extração. Pipetar 2 ml de hexano em cada reservatório, para condicionar os cartuchos. Permitir que o líquido passe através dos cartuchos. Pipetar o extracto da amostra a GPC para o reservatório e, novamente, para permitir que o líquidopassar através do cartucho. Recolher o fluido de amostra no frasco e retire do colector. Não descarte eluato. Coloque um novo frasco de 10 ml coleta seca limpa em rack e colocar dentro de colector de extração. Para lavar o cartucho, adicionar 2 ml de acetato de etilo em hexano (30% v / v) para o reservatório e puxar o líquido através do cartucho. Repetir com mais 2 ml de acetato de etilo em hexano, descartando-se todas as lavagens. Coloque o original 10 frasco ml coleção (passo 1.2.3.2) de volta na prateleira dentro do colector de extração. Pipetar 2 ml de acetato de etilo em acetona (50% v / v) para dentro do reservatório, ligar a bomba de vácuo (abaixo de 2 inHg para permitir um débito de menos do que 2 ml por minuto) e puxar o líquido através de dentro do frasco . Repetir o processo com mais 2 ml de acetato de etilo. Retirar o frasco de amostras e utilizar um concentrador para reduzir o volume de extracto para 1 ml. Transferir a amostra para um frasco de vidro menor e usar azoto soprar para baixo equipamento, para evaporar tele extrair à secura incipiente. Adicionar 100 ul de metanol e misturar bem. Transfira o extrato com um auto-amostrador frasco (com 0,3 ml de inserção) e tampa do frasco. Analisar as amostras usando LCMS / MS (ver secção 2). Coluna: gel de PL, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5? M Coluna Guard: gel de PL, 50 x 7,5 mm, 5? M Na fase móvel: diclorometano Quociente de vazão: 1 ml por minuto Temperatura da coluna: 25 ° C Detector de UV: 210 nm Volume de injecção: 95 ul Modo de injeção: Ficar de péard Desenhe velocidade: 500 ml por minuto Ejectar velocidade: 500 ml por minuto Posição Draw: 3 milímetros Fracção recolhida: 3 ml da fracção (7 – 10 min) em 10 ml de frascos Tabela 1. Condições e parâmetros para Gel cromatografia de permeação (GPC) clean-up de amostras de águas residuais extraídos. Detalhes da tabela coluna GPC, fase móvel, temperatura, volume de injeção, eo comprimento de onda do detector. extração da amostra (para tela Yeast estrogênio) amostras de filtro, conforme detalhado no ponto 1.2.1.1. Anexar forros descartáveis ​​válvulas, cartuchos C18 SPE e reservatórios de cartucho para o aparelho de SPE. Ligar a bomba de vácuo para testar o equipamento está adequadamente vedado. Pipetar 5 ml de metanol em cada reservatório, para condicionar o C18 cartuchos. Ligue vácuo (a cerca de 5 inHg para permitir um fluxo de cerca de 5 ml por minuto) e deixar a corrida líquido através, parando por 1 min meio do caminho. Não deixe os cartuchos de correr seca. Repita o processo com qualquer grau HPLC ou água bidestilada (ddH2O). Mais uma vez não secam. Extrair amostras de água como descrito na seção 1.2.1.4. Continuar a vácuo durante pelo menos 30 min para secar completamente os cartuchos. Coloque os frascos de coleta de 10 ml limpas e secas em um rack no colector de extração. Verifique se cada forro é acima de um frasco. Adicionar 5 ml de metanol para cada reservatório. Ligue o vácuo (fluxo máximo de 5 ml / min) e permitir que o líquido passe através do cartucho para o frasco, detendo-se durante 2 min a meio. Antes da análise usando a tela de SIM, reduzir o extracto à secura incipiente usando nitrogênio e reconstituir com 500-1.000 etanol ul. Selar as tampas dos frascos de amostra para evitar a evaporação e manter a 4 ° C (em um free-faíscageladeira). 2. Análise química usando LCMS / MS Optimizar as condições de funcionamento do sistema LCMS / MS utilizando as instruções do fabricante. Analisar soluções de calibração padrão, os extractos da amostra, em branco e analítico de controle de qualidade amostras (AQC), utilizando a cromatografia líquida e condições de espectrometria de massa, e monitorar as transições de íon como detalhado na Tabela 2. Determinar a concentração de estrogênios esteróides no extracto de amostra usando interna normas 10. LCMS Cromatografia líquida Coluna: C18 (2), 150 x 4,6 mm, 5 um. Volume de injecção: 20 ul Fluxo: 0,5 ml por minuto. Mfase óvel: Solvente A: água contendo 0,1% de amoníaco. Solvente B: acetonitrilo. Programa de gradiente: Tempo (min) 0 10 18 24 28 Na relação A: solvente B 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00 Espectrometria de massa Fonte: Electrospray (iões negativos) Gás e fonte: CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi TEM: 600 ° C, gás CAD 5 e IonSpray tensão -900 transições de MRM: </td> E1: 269/145 e 269/143 E2: 271/145 e 271/143 EE2: 295/145 e 295/143 E1-D4: 273/147 E2-D4: 275/147 EE2-D4: 299/145 Tabela 2. Detalhes parâmetros e condições para a análise LCMS / MS de estrogênios esteróides em extratos de águas residuais. Tabela dá volume injeção da amostra e taxa de fluxo, as condições de fase móvel Agradiente nd. 3. estrogénica Atividade Usando In Vitro Tela Yeast estrogênio (YES) Ensaio 8 Preparar e armazenar o mínimo de componentes de média e média de acordo com a Tabela 3 (a) a (g). (a) meio mínimo (pH 7,1): Prepara-se uma Fe 2 (SO 4) 3 pela adição de solução de 40 mg de Fe 2 (SO 4) 3 a 50 ml de água bidestilada (ddH2O) Adicionar 1 L ddH2O para um copo de vidro de 2 L Adicionar os seguintes componentes para a proveta: 13,61 g KH 2 PO 4 1,98 g de (NH 4) 2 SO 4 4,2 g de KOH 0,2 g de MgSO4 1 ml de Fe 2 (SO 4) <sub> 3 solução 50 mg de L-leucina 50 mg de L-histidina 50 mg de adenina 20 mg de L-arginina-HCl 20 mg de L-metionina 30 mg de L-tirosina 30 mg de L-isoleucina 30 mg de L-lisina-HCl 25 mg de L-fenilalanina 100 mg de ácido L-glutâmico 150 mg de L-valina 375 mg de L-serina Coloque o copo no agitador aquecida com uma pulga magnética e mexa até que tudo é dissolvido Verifique se o pH é 7,1 e ajustar, se necessário Usando um 50 ml seringa estéril dispensar 45 ml alíquotas em frascos de vidro com tampas superior parafuso de metal Esteriliza-se o meio mínimo a 121 ° C durante 10 minutos numa autoclave Armazenar em temperatura ambiente (b) D – (+) – Glucose: Prepara-se uma solução de 20% w / v em ddH2O Dispensar 20 ml alíquotas para frascos de vidro com tampas superior parafuso de metal Esterilizar a solução de glucose a 121 ° C durante 10 minutos numa autoclave Armazenar em temperatura ambiente (c) Ácido L-Aspártico: Produzir uma solução stock de 4 mg / ml em ddH2O Dispensar 20 ml alíquotas para frascos de vidro com tampas superior parafuso de metal Esterilizar a solução de L-ácido aspártico a 121 ° C durante 10 minutos numa autoclave Armazenar em temperatura ambiente (d) Solução de vitamina: Prepara-se uma solução de biotina por adição de 2 mg de biotina a 100 mL de ddH2O Pesar 8 mg de tiamina, piridoxina 8 mg, 8 mg de ácido pantotênico, 40 mg inositol. Adicionar todos os componentes secos e 20 ml de solução de biotina a 180 ml ​​de ddH2O Adicione 10 ml alíquotas estéreis por filtração através de um filtro descartável de tamanho de poro de 0,2 | iM em frascos de vidro estéreis, numa câmara de fluxo laminar de ar Armazenar a 4 ° C (e) L-Treonina: Preparação de 100 ml de 24 mg / ml de L-treonina em ddH2O Dispensar 10 ml alíquotas para frascos de vidro com tampas superior parafuso de metal Esterilizar a solução de L-treonina a 121 ° C durante 10 minutos numa autoclave Armazenar em temperatura ambiente <stRong> (f) de cobre (II) Sulfato: Preparar 25 ml de uma solução 20 mM de cobre (II) Sulfato em ddH2O Faça alíquotas de 5 ml esterilizadas por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 | iM em frascos de vidro estéreis, numa câmara de fluxo laminar Armazenar em temperatura ambiente (g) vermelho de clorofenol-β-D-galactopiranósido (CPRG): Preparar 25 ml de uma solução a 10 mg / ml de CPRG em ddH2O Faça alíquotas de 5 ml esterilizadas por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 | iM em frascos de vidro estéreis, numa câmara de fluxo laminar Armazenar a 4 ° C Tabela ensaio Tela estrogênio 3. levedura; preparação e armazenamento dos mínimos componentes de média e média. Preparação e storage de 10x cultura de levedura concentrado No dia 1, preparar o meio de crescimento (tal como descrito no ponto 3.4.1) e despeje em um frasco cónico estéril. Adicionar 125 ul de 10x concentrado a partir de levedura frasco criogénico armazenado a -20 ° C. Incubar o meio inoculado a 28 ° C durante cerca de 24 horas num agitador orbital. No dia 2, fazer duas garrafas de meio de crescimento (~ 50 ml) e despeje em frascos cónicos estéreis separadas. Adicionar 1 ml de 24-hr de levedura cultivadas em cada frasco de meio de crescimento. Incubar o meio inoculado a 28 ° C durante cerca de 24 horas num agitador orbital. No dia 3, verter cada cultura de 24 h para um tubo de centrífuga de 50 mL estéril. Centrifugar os tubos de 50 ml a 4 ° C durante 10 min a 2000 x g. Decantar o sobrenadante, e re-suspender cada sedimento em 5 ml de meio mínimo com 15% de glicerol. Faça alíquotas de 0,5 ml da cultura de levedura concentrado 10x em criotubos e armazenar estéreis de 1,2 ml a -20 ° C durante um máximo de 4 meses. Prepastocks químicos ração e armazenamento de curvas padrão para Lavar todos os vidros e espátulas duas vezes com etanol absoluto e deixar secar antes de usar para remover qualquer vestígio de contaminantes. Pesar E2 directamente num frasco de vidro numa câmara de pesagem pó e ajuste a concentração em volume em etanol absoluto. Dilui-se a uma concentração de 2×10 -7 M (54,48 g / L). tampa de vedação e armazenar a 4 ° C (no frigorífico livre de faísca). produtor ensaio No dia 0, preparar o meio de crescimento. Para a garrafa de 45 ml de meio mínimo de 5 ml da solução de glicose, 1,25 ml de solução de ácido L-aspártico, 0,5 ml de solução de vitaminas, 0,4 ml de solução de L-treonina, e uma solução de sulfato de cobre 125 ul (II). Pour meio de crescimento num balão cónico estéril. Adicionar 125 ul de estoque de 10x concentrado (descongelada do armazenamento a -20 ° C) ao balão e incubar o meio inoculado a 28 ° C durante cerca de 24 horas num agitador orbital. No dia 1, um rótulo de 96 cavidades 'placa de diluição "estéril e fazer diluições em série (100 ul volume em etanol) de E2 curva padrão e químico (s) de teste / extracto de efluente (s) (por exemplo, EE2). Etiqueta estéreis de 96 poços 'placa de ensaio (s)' opticamente fundo plano microtitulação. Em cada placa incluir espaços em branco (mais / menos) de solventes e uma curva padrão de E2, além de linhas de produto químico (s) de teste / extracto (s) de efluente. Pipetar 10 ul de cada concentração de (E2, químicos ou extracto) para o poço apropriado da placa de ensaio. Pipetar 10 ul de etanol em cada poço 'solvente em branco "da placa de ensaio. Deixar placa de ensaio com a tampa para evaporar à secura. Adicione um frasco de meio de crescimento (~ 50 ml) e adiciona-β vermelho-D-galactopiranósido 0,5 ml de solução de clorofenol (CPRG) por frasco. Determinar a densidade de células de levedura em cultura a 24 horas pela medição da turbidez da cultura a 620 nm num leitor de placas. Inocular o ummédio ssay com 4×10 células de levedura 7 a partir da cultura de 24 horas. Pour meio de ensaio inoculado em uma calha estéril. Usando uma pipeta de multi-canal adicionar 200 uL de meio de ensaio inoculado para cada poço da placa de 96 poços de ensaio. Coloque a tampa sobre a placa de ensaio de 96 poços e selar as extremidades com fita. Agitar a placa (s) de ensaio vigorosamente durante 2 min num agitador de placas de titulação e incubar a 32 ° C numa câmara de aquecimento naturalmente ventilado. No dia 2, agitar a placa (s) de ensaio vigorosamente num agitador de placa de titulação durante 2 min. Voltar para 32 ° C incubadora. No dia 4, agitar a placa (s) de ensaio vigorosamente durante 2 min num agitador de placas de titulação. Deixar a placa (s) em repouso durante cerca de 1 h, em seguida, ler a placa (s) de ensaio a uma absorvância de 540 nm (absorção óptima para CPRG ~ 575 nm) e 620 nm (para a turbidez) utilizando um leitor de placas. Deixar placa (s) à temperatura ambiente e lido mais tarde, se necessário. cálculos atividade estrogênica <ol> leituras correctas de ensaio para a turvação, utilizando a equação seguinte: Valor corrigido = amostra ou padrão (E2) de absorvância a 540 nm – [absorvância padrão (E2) ou amostra a 620 nm – em branco absorvância a 620 nm]. Lote E2 curva padrão com espaços em branco apropriados (para verificar se há contaminação) 8. Utilizar o exemplo corrigido (extrato ou químico) para calcular 'equivalentes' Estradiol. Use as E2 valores curva padrão plotados e equação de regressão (3 parâmetros polinomial ou linear, dependendo fit) para interpolar a amostra / extrair os valores de absorção para valores equivalentes E2. Uso factor de concentração (isto é, água e extraiu-se o volume de etanol ao extracto é re-suspenso em) para calcular a actividade estrogénica na amostra pré-extraída. 4. Avaliação Based Laboratório de estrogênico Atividade Usando In Vivo VITELOGENINA Indução em Male Fathead Minnows Use peixinhos fathead do sexo masculino (PimephalesPimephales)> 4 meses de idade, que exibem características sexuais secundárias (isto é, o desenvolvimento de tubérculos nuptial e um fatpad dorsal) indicativo de determinação sexual masculina. Para evitar que a atividade de desova, separada madura machos três semanas (± 3 dias) antes do início do teste. Configure pelo menos dois 45 L aquários de vidro com uma carga máxima de 3 g / L. Para assegurar um número suficiente de peixe saudável para o teste, utilizar um mínimo de 100 machos. Manter o peixe macho sob condições ambientais idênticas como será experimentada no teste (ou seja, a temperatura da água de 25 ± 1 ° C e 16: 8 hr de luz: escuro fotoperíodo). Manter a taxa de fluxo da água de diluição para cada tanque de garantir um tempo de substituição de 95% de, pelo menos, a cada 6 a 8 horas, ou seja, 330 ml / min para um tanque de 45 litros. equipamento de ensaio e delineamento experimental Use tanques de vidro grandes para acomodar uma carga de até 3 g de peixe por litro de water. Para 8 machos adultos (nominalmente 4,5 g cada), use um tanque de 10-20 L. Use dois tanques repetidos para cada tratamento e proteger cada tanque de quaisquer distúrbios visuais desnecessários (isto é, usar telas cartão laminado entre os tanques). Identificar cada tanque com um número de estudo, uma concentração de exposição e um número de identificação da embarcação. Para os estudos de efluentes de águas residuais Na chegada, imediatamente transferir efluente para um tanque de armazenamento a 10 ± 1 ° C. Iniciar a dosagem efluente dentro de duas horas após a recepção do efluente. Alimentação do efluente, através de uma bomba peristáltica, a partir do tanque de armazenamento de 10 ° C para um recipiente de aclimatação. Aquecer o efluente no recipiente de aclimatação a 18 ± 2 ° C. Bombear o efluente aquecido a partir do recipiente para a dosagem de aclimatação / recipientes de mistura e, em seguida, para o teste de aquários (que contém o peixe). Aquecer os aquários a uma temperatura de 25 ± 1 ° C. Para os estudos de dosagem química Pesar produtos químicos de teste em um gabinete de pó de pesagem. Prepare existências químicas concentradas em ddH2O de preferência sem a utilização de solventes. Nota: Se solventes são necessários para solubilizar os compostos de teste, utilizar controlos do solvente, além da água de diluição de controlo. alimentação por gravidade ou água de diluição da bomba de um tanque de cabeçalho de temperatura controlada via dispositivo (s) de controle de fluxo para dosagem / vaso de mistura. Bomba de concentrado da (s) químico utilizando um sistema de bombagem peristáltica para o doseamento / recipientes de mistura. Controlar a taxa de bomba (de química estoque) e taxa de fluxo de água (água de diluição) para atingir a concentração de exposição desejado. Nota: Use tubo de silicone para alimentar químico das águas / teste para cada recipiente de ensaio da dosagem / vaso de mistura. Usar um caudal que é suficiente para proporcionar uma substituição vaso de 75% em pelo menos 24 horas, isto é, 20 ml / min para um tanque de 20 litros. Manter o caudal a ± 10% do valor nominal especificado. </li> Manter a temperatura da água do tanque de exposição a 25 ± 1 ° C, o oxigénio dissolvido acima de 70% do valor de saturação de ar (5,8 mg L-1 a 25 ° C) e ± 0,5 unidades de pH a partir de pH (entre 6,5 e 8,5) ao longo do estudo. Definir condições de iluminação ao fotoperíodo de luz 16 horas: 8 h escuro, com períodos de transição / crepúsculo amanhecer de 20 min. Alimentar os peixes duas vezes por dia com recém-descongelado adulto congelada salmoura camarão (Artemia) a 2,5 (± 0,1) g por tanque por feed. Também alimentar os peixes uma vez por dia com uma pequena quantidade (dois pitada dedo) de um alimento em flocos peixes tropicais. Deixar um mínimo de 3 horas entre cada feed. Mantenha um registro alimentação diária para monitorar a resposta de alimentação / comportamento (boa, moderada ou pobre, em comparação com os controles). Sifão os tanques, pelo menos, duas vezes por semana (de preferência diariamente) para remover qualquer restos de comida e fezes. Limpe os lados e fundo dos recipientes de ensaio pelo menos uma vez por semana. Tome amostra de água semanals de cada tanque para confirmar atividade estrogênica (via tela de levedura) e composição química (via química analítica). Consulte as secções 1-3 para detalhes de amostragem de água, extração e análise. Nota: Para cada experiência, utilizar água de diluição de controlo (controlo negativo), controlo positivo (E2 ou EE2) e de pelo menos três diluições de efluente (100, 50 e 25%) ou produtos químicos de teste para monitorizar a resposta de dose. Se novas tecnologias são testados, utilizar composto / efluente com ou sem tratamento (por exemplo, EE2 sem tratamento, com EE2 TAML / peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) tratamento de 12; Figura 1). Figura 1. Diagrama representando delineamento experimental de um bioensaio in vivo vairão vitelogenina para determinar a remoção de ecotoxicidade do 17α-etinilestradiol usando TAML / tratamento de água peróxido. A experimental configurar consiste em oito 11 L aquários de vidro cada alimentados com fluxo contínuo de água. soluções de produtos químicos individuais e água (filtrada de-clorada) são entregues para as câmaras de mistura. Concentrações nominais (sem reação) nos vasos de mistura são de 2 ng / L EE2, 80 nM TAML e 0,16 g / LH 2 O 2. Soluções de Química (EE2, H 2 O 2 e TAML) são preparadas e doseadas separadamente para que as reacções de início nos vasos de mistura. Peixe (8 do sexo masculino peixinhos fathead por tanque) são expostas à mistura (s) depois de um tempo de contacto de reacção de cerca de 45 minutos. As amostras de água são retirados dos tanques de exposição semanais. As amostras de plasma são tomadas a partir peixinhos fathead para medir a vitelogenina biomarcador estrogénica (VGT) a partir de um grupo de linha de base, no início do estudo, e todos os outros peixes após 21 dias de exposição. Os tratamentos específicos são: 'C'; controle negativo (água de diluição apenas), '+'; controlo positivo de EE2,'+ H'; EE2 mais H 2 O 2, '+ T'; EE2 mais H 2 O 2, mais TAML. Este valor foi modificado a partir Mills et al. 2015 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Procedimento de teste período de aclimatação Medir o peso molhado (g) de cada peixes machos sexualmente maduros, e alocar aleatoriamente para cada tanque (8 machos por tanque). Manter os peixes não afectados do mesmo lote e mantê-las sob as mesmas condições de ensaio. Use estes peixes para substituir todos os indivíduos que apresentam sinais de danos físicos ou a falta de condições durante o período de aclimatação de 7 dias. Assegurando, ao fim do período de aclimatação de cada tanque de tratamento tem 8 machos que tenham completamente aclimatados às condições de ensaio. Tome amostras de plasma 'de base' de um adicional de 8 machos da mesma batch de peixes machos. Siga o método de amostragem de sangue na secção 4.4 e o método de análise vitelogenina (VTG) em 4,5. Após o período de aclimatação, entregar stocks de dosagem de efluentes ou químicos para os tanques de exposição durante 21 dias, conforme descrito no 4.2.2 ou 4.2.3. Monitor de mortalidade, o comportamento e a aparência física dos peixes em cada tanque de replicar diariamente antes da primeira refeição do dia. Grave qualquer comportamento ou incidentes anormais. Nota: Certifique-se de condições ambientais e as taxas de alimentação manter a saúde dos peixes (pontos 4.2.4 e 4.2.5). Amostragem de peixes após o período de exposição de 21 dias 12 horas antes da amostragem, parar de alimentar os peixes. Etiqueta tubos micro-centrífuga para a recolha de amostras de sangue, adicione ~ 5 mL de aprotinina (um inibidor de protease) e colocá-los no gelo. Adicione uma solução de 500 mg / L de MS222 (anestésico) por dissolução de 500 mg de MS222 por 1 L de água clorada-des (previamente aclimatadoa 25 ± 1 ° C). Neutraliza-se a MS222 para pH 7,4 ± 0,4 usando NaOH 1 M. Mova cada peixe do tanque para o MS222 tamponada. Mantenha na solução até à cessação de todo o movimento opérculo (tipicamente 5 ± 1 min). Meça e registre o comprimento do garfo (mm) sob a anestesia terminal. Usar um bisturi descartável para amputação da cauda, ​​e usar um tubo heparinizado o hematócrito para recolher o sangue a partir da artéria caudal (Figura 2). Cuidadosamente dispensar o sangue para dentro do tubo de microcentrífuga pré-rotulados e manter em gelo. Matar os peixes imediatamente depois de desenhar o sangue. Confirmar morte por cessação permanente da circulação e / ou a destruição do cérebro. Meça e registre o peso do peixe total (a mais próxima de 0,01 g), e dissecar tecidos, conforme necessário. Centrifuga-se o sangue (7000 x g durante 5 min a 4 ° C) dentro de 2 horas de recolha. Transferir o sobrenadante de plasma com uma pipeta em um novo 0,4 ml banheira de microcentrífuga rotuladoes e armazenar no gelo. Congelar os tubos contendo plasma em gelo seco dentro de 30 min de centrifugação e armazenar a -80 ° C antes da análise das concentrações de plasma VTG. Figura 2. Fotos que retratam peixinho masculino fathead (Pimephales promelas), coleta de plasma e localização dos testículos. No final da exposição de 21 dias todos os peixes devem ser mortos para recolher amostras de sangue. Uma vez sob este comprimento terminal de anestésico peixe (comprimento do garfo, mm) deve ser medido, rapidamente seguido por recolha de sangue da artéria caudal Photo-A:. ​​Linha pontilhada vermelha indica o local de amputação de cauda (um bisturi descartável deve ser utilizado para amputar a cauda ). Photo-B mostra um tubo heparinizado o hematócrito usado para coletar o sangue. Cada peixe deve então ser mortos imediatamente após a sua amostra de sangue foi feita, neste caso, toda a cabeçafoi separada do corpo (Foto-C). Uma vez que o peixe foi morto na cavidade do corpo pode ser aberto para revelar os órgãos internos. Photo-C mostra a localização dos testículos (gônadas) em relação à bexiga natatória (SB) em peixes ciprinídeo, por exemplo, vairão, barata, carpa, etc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Medir as concentrações VTG plasma com um kit de ligado a enzima homóloga VGT ensaio imunoabsorvente (ELISA) desenhado especificamente para peixinhos fathead. Preparar padrões e tampões VTG como descrito no protocolo do fabricante. Dilui-se a amostra de plasma 1:50, 1: 5000 e 1: 500000 e ensaiar-los em duplicado para obter leituras dentro da gama da curva padrão VTG conforme as instruções do fabricante. Siga as orientações do fabricante para calcular as concentrações de vitelogenina. </li> 5. avaliações de campo da Advanced / Novel Tratamento de Águas Residuais Technologies para Mitigar estrogénica Atividade Usando In Vivo vitelogenina e Intersex Indução em Roach (Rutilus Rutilus) Captura de Roach selvagens que vivem a jusante do emissários ETAR Nota: Use roach (Rutilus Rutilus) ou outras espécies abundantes água doce ou salgados, que são gonochoristic e conhecido por ser sensível à desregulação endócrina estrogênica. Captura de peixes utilizando pesca elétrica, compensação, prendendo ou outros métodos de pesca reconhecidas, dependendo da situação 13. Transportar o peixe em tanques gaseificadas volta ao laboratório para amostragem. Preparar tubos de microcentrífuga como detalhado em 4.4.2. Prepare tamponada MS222 como descrito em 4.4.3. Anestesiar os peixes como detalhado em 4.4.4. Medir o comprimento dos peixes e peso sob anestesia terminal. Recolha de sangue do caudal da artéria usando disposeringa heparinizada sable. Matar uns aos peixes imediatamente após a coleta de amostra de sangue. Cuidadosamente dispensar o sangue em tubos de microcentrífuga pré-rotulados e manter em gelo. Prepare de plasma tal como descrito no passo 4.4.7 e medir VGT por ELISA (4,5). Utilizando uma pinça remover 2-3 escamas de peixe de cada peixe e colocar em envelopes de papel pequenas marcados individualmente. envelopes Armazenar à temperatura ambiente em condições secas para determinação da idade dos peixes mais tarde e análise de crescimento. Abrir a cavidade do corpo com um bisturi para revelar os órgãos internos. Retire o intestino para revelar a bexiga natatória com uma gonadal localizados em cada lado (figura 2). Remova cuidadosamente as gônadas emparelhados com uma pinça de nariz fino e coloque em um frasco de vidro. Cobrir as gónadas com fixador de Bouin, na proporção de 1:10 de tecido: fixador. Deixar o tecido em Bouin durante 6-24 horas, dependendo do tamanho do tecido (fixador penetra a 1 mm por hora). Uma vez fixado, despeje um fixador do BouinD Substituir com 70% de álcool desnaturado industrial (IMS). Armazenar o tecido fixado à temperatura ambiente até que os tecidos são processados ​​para histopatologia (secção 5.3). Campo avaliação baseada da atividade estrogênica usando indução in vivo vitelogenina e intersex na roach O delineamento experimental e configurar Nota: Configure os tanques e planta piloto com bastante antecedência da in vivo o trabalho de partida. Iniciar os tanques de fluxo de 3-4 semanas antes de qualquer adição de peixe para o sistema. Monitorar as taxas de fluxo de água, qualidade e condições (pH, temperatura, oxigênio dissolvido, etc.) regularmente para se certificar parâmetros de água pode ser mantida. Construir tanques grandes (por exemplo, 300-1,000 L) no local, a planta piloto, que pode receber "controle" de-clorada água da torneira, efluente tratado padrão (s) e avançado de efluentes (s) tratada em paralelo. Anexar bomba de ar / aeradores para os tanques. caudais de água estabelecidos para cumprir, pelo menos, 6 tanque de vtrocas OLUME por dia. Nota: Certifique-tanques com certeza são bem isolado e protegido para evitar flutuações de temperatura diurna excessiva. Tanques de design para permitir a observação do peixe, por alterações comportamentais (falta de alimentação, etc.), sinais de doença e mortalidade. Comece a exposição flutuante os sacos de barata (a partir da fazenda de peixes) nos respectivos tanques durante 1 h. Adicione a água do tanque para os sacos gradualmente até a temperatura da água e as condições são ambiente. Solte o peixe em seus tanques. Alimente roach adulto diariamente em comida de peixe peletizada (tamanho 0,5-0,8). Alimente roach juvenil diariamente na pequena peletizada (tamanhos de pelotização 100-300) não estrogênica de alimentação 14 ad libitum, ajustado com base em alimentos não consumidos. Mantenha um registro de alimentação resposta de alimentação documentação / comportamento diário (bom, moderada ou pobre, em comparação com os controles). Recolher amostras de água semanais de cada tanque para confirmar atividade estrogênica e composição química. See seções 1-3 para detalhes de métodos de amostragem de água e análise. O exame histopatológico de peixes gônadas 15 Remova cuidadosamente as gônadas dissecados e fixos (descritas nos passos 5.1.6 e 5.1.7) do recipiente com uma pinça e coloque sobre uma placa de corte. Use uma lâmina de micrótomo para cortar cada gônada em 3 partes (anterior, médio e posterior) e de cada parte cortada uma secção transversal de espessura de 3-5 mm. Cuidadosamente colocar todas as seis peças numa cassete de biópsia de plástico rotulados e colocar em processador de tecidos usando as temporizações listados na Tabela 4. Cera tecidos incorporar e seção sobre micrótomo rotativo (3-5 mm). secções de transferência para lâminas de vidro revestido de bio-adesivo e rotulados Colocar as lâminas em uma placa aquecida (fixada em 45 ° C) para secar durante 24 h. Corar as lâminas, quer manualmente ou utilizando um corante automatizado, utilizando os intervalos descritos na Tabela 5. Colocar uma gota de agente de montagem sobre o tecido manchado, e Lay uma lamela de vidro sobre o agente de montagem para proteger o tecido. Em primeiro lugar, examine cada slide com pequeno aumento (20X, ou seja objectiva 2X, com linhas 10X olho ampliação) para determinar o sexo eo número de pontos de anexos para a cavidade do corpo 15. Nota alguma anomalia para cada peixe. Numa ampliação mais elevada (100X ou 400X), examinar o tecido para avaliar as fases gametogenesis, anomalias e a presença de oócitos em tecido testicular. Grave a gravidade da hermafroditas usando o seguinte sistema de classificação que varia de 0 (tecido normal do sexo masculino) para (tecido ovariano 100%) 7 6 (ver Tabela 6). Número etapa Tratamento propósito Tempo (h) 1 70% de IMS Desidratação 3 2 90% de IMS Desidratação 2.5 3 95% de IMS Desidratação 1,5 4 100% IMS Desidratação 1,5 5 100% IMS Desidratação 1,5 6 100% IMS Desidratação 1,5 7 100% IMS Desidratação 1,5 8 Agente de Compensação Histologia clareira 1,5 9 Agente de Compensação Histologia clareira 1,5 10 Agente de Compensação Histologia clareira 1.5 11 CERA infiltração de cera 1,25 12 CERA infiltração de cera 1,25 Total 20 hr Tabela 4. regime de Processamento para a cera impregnar tecidos para exame histopatológico. Os tecidos devem ser tratados em um processador de tecido automático. Os tecidos devem ser imersos nas soluções detalhadas para o período de tempo especificado. Mancha não. Mancha propósito Tempo (min) 1 agente de Histologia Clearing dissolve a cera 15 2 <td> 100% IMS hidratação 2 3 90% de IMS hidratação 2 4 70% de IMS hidratação 2 5 ÁGUA DA TORNEIRA (em execução) Rinse 2 6 HAEMOTOXYLIN núcleos celulares manchas azuis 10 7 ÁGUA DA TORNEIRA (em execução) Retire o excesso de 10 8 acidificada IMS dechlorination 20 seg 9 ÁGUA DA TORNEIRA (em execução) Rinse 20 seg 10 Lico 3 sal 20 seg 11 ÁGUA DA TORNEIRA (em execução) Rinse 20 seg 12 1% Eosina (aquoso) Manchas rosa citoplasma 20 seg 13 ÁGUA DA TORNEIRA (em execução) Retire o excesso de 5 14 70% de IMS Desidratação 2 15 90% de IMS Desidratação 2 16 100% IMS Desidratação 5 17 agente de Histologia Clearing Remover IMS agente de ligação 5 Tabela 5. Soluções e tempos de imersão para hematoxilina e eosina (H & E) coloração de tecidos gonadal dos peixes. As lâminas devem ser colocados em cada banho para a alocaçãociado vez em sequência. coloração H & E de tecidos é necessária para determinar os impactos de desenvolvimento ou organização de efluentes de águas residuais estrogênicos nas gónadas de peixe. Ponto seção Descrição 0 testículo normal masculino 1 Multifocal ovotestis com 1-5 oócitos (geralmente sozinhos) espalhados entre o tecido testicular 2 ovotestis multifocal, 6-20 oócitos muitas vezes em pequenos grupos espalhados entre o tecido testicular 3 ovotestis multifocal, 21-50 oócitos em clusters 4 > 50 <100 e oócitos. Secção é geralmente multifocal e tem a aparência de um mosaico de testeicular e tecido ovariano. 5 > 100 oócitos, geralmente multifocal, mas também poderia ser focal com zonas claramente identificáveis ​​de tecido de ovário e de testículo separada do tecido testicular. 6 > 50 por cento do tecido gonadal sobre a secção é do ovário e é claramente separada do tecido testicular por células epiteliais e tecidos fagocíticas. 7 100 por cento de tecido gonadal sobre a secção é ovário. Tabela 6. Sistema de pontuação para avaliar a gravidade da condição intersexual em Roach. Histologicamente lâminas preparadas de tecido gonadal deve ser examinado sob microscópio de luz, em 20X, 100X e 400X ampliação, para avaliar qualquer anormalidade e a presença de ovócitos no tecido testicular. Esta tabela é modificada a partir Jobling <em> et al. 2006 6.