Die Verwendung einer Batterie von chemischen und ökotoxikologischen Methoden zur Beurteilung der Wirksamkeit von Abwasserbehandlungsprozesse zu entfernen Estrogenic Potency

Ethik-Anweisung: Protokolle für endokrine Beurteilung störende Aktivität Stoffe / Gemische in Fisch wurden von der Brunel University in London Tierschutz und ethische Überprüfung zuständige Gremium (AWERB) und von der britischen Home Office im Rahmen der Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 genehmigt. 1. Wasserprobenentnahme, Konservierung und Extraktion Probensammlung und Konservierung Vor dem Gebrauch reinigen Sie die Flaschen mit einem geeigneten oberflächenaktiven Reinigungsmittel. Nach der Reinigung spülen Sie die Flaschen mit Wasser, abtropfen lassen und trocken. Proben werden in Glasflaschen von 2-L Kapazität ein Konservierungsmittel, bestehend aus 0,5 g Kupfer (II) -nitrat und 6 ml 3.6 M Salzsäure-Lösung enthält. Lagern Sie die Proben unter 10 ° C. Extrahieren und analysieren so bald wie möglich nach der Entnahme und Konservierung. Probenextraktion und clean-up (für Steroid – Östrogen – Analyse) 10 Festphasenextraktion (SPE) Vor der Extraktion zu reduzieren Schwebstoffe, Filterwasserproben unter Verwendung von 1 & mgr; m-Filterpapier Porengröße. Sobald gefiltert, Spike – Proben mit internem Standard durch Zugabe von 100 & mgr; l von deuterierten internen Standard – Stammlösung Spick enthält 2,4,16,16-d 4 -estrone: 2,4,16,16-d 4 -17β-Estradiol (E2) : und 2,4,16,16-d 4 -17α-Ethinylestradiol (EE2) (alle bei 40 ug / l in Methanol) auf 1000 ml Abwasser (oder 100 ml Zufluß) für Abwasser in interne Spitze von 2 ng / L resultierende Abwasserproben und 20 ng / l für Abwasser einfließenden Proben. Bringen Sie Einwegventil Liner, Styroldivinylbenzol SPE-Kartuschen und Kartuschenreservoirs auf die SPE Vorrichtung. Schalten Sie Vakuumpumpe, das Gerät zu testen, ist ausreichend abgedichtet. Pipette 5 ml Ethylacetat in jedem Behälter, die Patronen zu konditionieren. Einschalten der Vakuumpumpe (unter 10 inHg eine Strömungsrate von weniger als 10 ml pro Minute zu ermöglichen)und ziehen durch die Flüssigkeit. Nicht die SPE-Kartuschen austrocknen lassen. Wiederholen Sie den Vorgang mit 5 ml Methanol von 5 ml Wasser. Top jede Patrone Behälter mit Wasser und verbinden 1/8 "PTFE-Schläuche zwischen den Patronenbehälter und Glasprobenflaschen. Schalten Sie das Vakuum mit einer Strömungsgeschwindigkeit von weniger als 10 ml pro Minute und damit die gesamte Probe durch die Kartusche zu passieren. leeren der Abfallflasche wie nötig. Gründlich trocknen Sie die SPE – Kartuschen unter Vakuum (oder durch die Luft oder Stickstoff) , bis die Kartuscheninhalt Farbe ändern (zB von dunkelbraun bis hellbraun). Setzen Sie sauberen, trockenen 10-ml-Glasfläschchen Sammlung in Rack- und Platz innerhalb des Abzuges vielfältig. Überprüfen Sie, dass jeder Liner über ein Fläschchen ist. Pipette 8 ml Dichlormethan in jeden Probenbehälter, Schalter an der Vakuumpumpe (Durchflussrate von weniger als 10 ml pro Minute) und ziehen Sie die Flüssigkeit, die durch in die Sammelfläschchen. Entfernen Sie 10 ml Fläschchen aus der SPE-Verteilerund verwenden Sie einen Konzentrator das Volumen auf 1 ml zu reduzieren. Bringen Sie jede Probe in Autosampler Fläschchen und konzentrieren sich weiter auf 100 & mgr; l unter Verwendung von Stickstoff umfallen Ausrüstung. Gelpermeationschromatographie (GPC) clean-up Injizieren 95 & mgr; l der eluierten Probenextrakt in die GPC ausgestattet HPLC unter Verwendung der Bedingungen , die in Tabelle 1. Konzentrieren Sie die GPC bis 200 & mgr; l Extrakt unten unter Verwendung eines Konzentrators und Stickstoffapparat umfallen und dann auf 2,0 ml mit Hexan bilden. SPE clean-up Bringen Sie Einwegventil Liner, Aminopropyl Patronen und Patronen Stauseen auf die SPE vielfältig. Setzen Sie sauberen, trockenen 10-ml-Glasfläschchen Sammlung in Rack- und Platz innerhalb des Abzuges vielfältig. Pipette 2 ml Hexan in jedem Behälter, die Patronen zu konditionieren. Lassen Sie die Flüssigkeit durch die Patronen zu passieren. Pipette, um die GPC Probenextrakt in den Behälter und lassen wieder die Flüssigkeit zuPass durch die Patrone. Sammeln Sie die Probeneluattröpfchens in dem Fläschchen und entfernen Sie aus dem Verteiler. Nicht Eluat verwerfen. Setzen Sie einen neuen sauberen, trockenen 10 ml Sammelgefäß in Rack und legen innerhalb Extraktion vielfältig. Um die Patrone zu waschen, 2 ml Ethylacetat in Hexan (30% v / v) zu dem Vorratsbehälter und ziehen die Flüssigkeit durch die Kartusche. Wiederholen mit weiteren 2 ml Ethylacetat in Hexan, verwirft alle Waschungen. Legen Sie das Original 10 ml Sammelgefäß (Schritt 1.2.3.2) zurück in Rack innerhalb des Abzuges vielfältig. Pipette 2 ml Ethylacetat in Aceton (50% v / v) in den Vorratsbehälter, einschalten der Vakuumpumpe (unter 2 inHg eine Strömungsrate von weniger als 2 ml pro Minute zu ermöglichen), und ziehen die Flüssigkeit durch in das Fläschchen . Wiederholen den Vorgang mit weiteren 2 ml Ethylacetat. Entfernen Sie das Probenfläschchen und verwenden Sie einen Konzentrator den Extrakt Volumen auf 1 ml zu reduzieren. Übertragen Sie die Probe in eine kleinere Glasfläschchen und verwenden Stickstoff umfallen Ausrüstung, verdunsten ter bis zur beginnenden Trockenheit extrahieren. 100 l Methanol und gut mischen. Übertragen Sie den Extrakt zu einem Autosampler Fläschchen (mit 0,3 ml Einsatz) und das Fläschchen verschließen. Analysieren Sie die Proben unter Verwendung von LCMS / MS (siehe Abschnitt 2). Spalte: PL-Gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 & mgr; m Schutzsäule: PL-Gel, 50 x 7,5 mm, 5 & mgr; m Mobile Phase: Dichloromethane Fließrate: 1 ml pro min Säulentemperatur: 25 ° C UV – Detektor: 210 nm Injektionsvolumen: 95 & mgr; l Einspritzmodus: Standard Zeichnen Sie Geschwindigkeit: 500 ml pro min Auswerfen Geschwindigkeit: 500 ml pro min Zeichnen Position: 3 mm Fraktion gesammelt: 3 ml-Fraktion (7 bis 10 min) in 10 ml Vials Tabelle 1. Bedingungen und Parameter für die Gelpermeationschromatographie (GPC) Sanierung von Abwasserproben extrahiert. Tabelle Details GPC – Säule, mobile Phase, Temperatur, Injektionsvolumen und Detektor Wellenlänge. Probenextraktion (für Hefe-Estrogen Screen) Filterproben wie in Abschnitt 1.2.1.1. Bringen Sie Einwegventil-Liner, C18 SPE-Kartuschen und Kartuschenreservoirs auf die SPE Vorrichtung. Schalten Sie die Vakuumpumpe, das Gerät zu testen, ist ausreichend abgedichtet. Pipette 5 ml Methanol in jedem Behälter, die C zu konditionieren18 Patronen. Schalten Sie Vakuum (bis etwa 5 inHg einen Strom von etwa 5 ml pro Minute zu ermöglichen), und lassen Sie die Flüssigkeit durchlaufen, eine Pause für 1 min auf halbem Weg durch. Lassen Sie sich nicht die Patronen trocken laufen. Wiederholen Sie den Vorgang entweder mit HPLC – Qualität oder doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O). Auch hier laufen nicht trocken. Extrahieren von Wasserproben, wie in Abschnitt 1.2.1.4 beschrieben. Weiter das Vakuum mindestens 30 min für die Patronen gründlich trocknen. Legen Sie sauberen, trockenen 10 ml Fläschchen Sammlung in ein Rack in der Extraktions vielfältig. Überprüfen Sie, dass jeder Liner über ein Fläschchen ist. 5 ml Methanol wurden zu jedem Reservoir. Schalten Sie das Vakuum (maximalen Durchfluss von 5 ml / min) und die Flüssigkeit durch die Kartusche in das Fläschchen zu passieren, pausiert für 2 Minuten auf halbem Weg durch. Vor der Analyse der JA-Bildschirm verwenden, um den Extrakt bis zur beginnenden Trockenheit unter Verwendung von Stickstoff zu reduzieren und mit 500-1.000 & mgr; l Ethanol wiederherzustellen. Verschließen Sie die Deckel der Probengefäße Verdunstung zu vermeiden und halten bei 4 ° C (in einem funkenfreiKühlschrank). 2. Chemische Analyse Mit LCMS / MS Optimieren Sie die Betriebsbedingungen des LCMS / MS-System Verwendung der Herstelleranweisungen. Analysieren Sie Kalibrierstandardlösungen, die Probenextrakte, Leer- und analytischen Qualitätskontrolle (AQC) Proben , die die Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie Bedingungen verwendet, und überwachen die Ionenübergänge , wie in Tabelle 2 aufgeführt. Man bestimmt die Konzentration von Steroid Östrogene im Probenextrakt mit internen Standards 10. LCMS Liquid Chromatography Spalte: C18 (2), 150 x 4,6 mm, 5 & mgr; m. Injektionsvolumen: 20 ul Fließen: 0,5 ml pro Minute. Mobile Phase: Lösungsmittel A: Wasser mit 0,1% Ammoniak. Lösungsmittel B: Acetonitril. Gradient-Programm: Zeit (min) 0 10 18 24 28 A: B-Lösungsmittel-Verhältnis 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00 Massenspektrometer Quelle: Elektro (negative Ionen) Gas und Quelle: CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi TEM: 600 ° C, CAD Gas 5 und Ionensprayspannung -900 MRM-Übergänge: </td> E1: 269/145 & 269/143 E2: 271/145 & 271/143 EE2: 295/145 & 295/143 E1-D4: 273/147 E2-D4: 275/147 EE2-D4: 299/145 Tabelle 2. Details Parameter und Bedingungen für LCMS / MS – Analyse von Steroid Östrogene in Abwasserextrakten. Tabelle gibt Probeninjektionsvolumen und Durchflussrate, mobile Phase Bedingungen einnd Steigung. Mit 3. östrogene Aktivität in vitro – Yeast Estrogen Screen (JA) Assay 8 Bereiten Sie und speichern Minimalmedium und Medium – Komponenten gemäß Tabelle 3 (a) bis (g). (a) Minimal Medium (pH 7,1): Bereiten einer Fe 2 (SO 4) 3 -Lösung durch Zugabe von 40 mg Fe 2 (SO 4) 3 bis 50 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) 1 L ddH 2 O in einen 2 l Glasbecher Fügen Sie die folgenden Komponenten in den Becher: 13,61 g KH 2 PO 4 1,98 g (NH 4) 2 SO 4 4,2 g KOH 0,2 g MgSO 4 1 ml des Fe 2 (SO 4) <sub> 3 Lösung 50 mg L-Leucin 50 mg L-Histidin 50 mg Adenin 20 mg L-Arginin-HCl 20 mg L-Methionin 30 mg L-Tyrosin 30 mg L-Isoleucin 30 mg L-Lysin-HCl 25 mg L-Phenylalanin 100 mg L-Glutaminsäure 150 mg L-Valin 375 mg L-Serin Das Becherglas auf beheizten Rührer mit einem magnetischen Floh und rühren, bis alles gelöst ist, Überprüfen Sie, dass der pH-Wert 7,1 und bei Bedarf einstellen Unter Verwendung einer 50 ml sterile Spritze 45 ml Aliquots verzichtet werden in Glasflaschen mit Metall Schraubverschluss Deckel Sterilisieren des Minimal Medium bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven Bei Raumtemperatur lagern (b) D – (+) – Glucose: Bereiten Sie eine 20% w / v Lösung in ddH 2 O Dispense 20 ml Aliquoten in Glasfläschchen mit Metall Schraubverschluss Deckel Sterilisieren der Glukoselösung bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven Bei Raumtemperatur lagern (c) L-Asparaginsäure: Machen Sie eine Stammlösung von 4 mg / ml in ddH 2 O Dispense 20 ml Aliquoten in Glasfläschchen mit Metall Schraubverschluss Deckel Sterilisieren des L-Asparaginsäure-Lösung bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven Bei Raumtemperatur lagern (d) Vitamin Lösung: Vorbereiten eines Biotin – Lösung durch Zugabe von 2 mg Biotin zu 100 ml ddH 2 O Man wiegt 8 mg Thiamin, 8 mg Pyridoxin, 8 mg Pantothensäure, 40 mg Inositol. Fügen Sie alle trockenen Komponenten und 20 ml der Biotin – Lösung auf 180 ml ​​ddH 2 O Machen Sie 10 ml sterilen Aliquots durch Filtrieren durch einen 0,2-um Porengröße Einwegfilter in sterile Glasflaschen, in einem laminaren Luftstrom Kabinett Lagerung bei 4 ° C (e) L-Threonine: Herstellung von 100 ml von 24 mg / ml L-Threonin in ddH 2 O Dispense 10 ml Aliquoten in Glasfläschchen mit Metall Schraubverschluss Deckel Sterilisieren der L-Threonin-Lösung bei 121 ° C für 10 min in einem Autoklaven Bei Raumtemperatur lagern <strong> (f) Kupfer (II) Sulfate: Vorbereitung 25 ml einer 20 mM Kupfer (II) -sulfatlösung in ddH 2 O Bilden 5 ml sterile Aliquots durch Filtrieren durch einen 0,2-um Porengrße Filter in sterile Glasflaschen, in einer laminaren Strömung Schrank Bei Raumtemperatur lagern (g) Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid (CPRG): Vorbereitung 25 ml einer 10 mg / ml Lösung von CPRG in ddH 2 O Bilden 5 ml sterile Aliquots durch Filtrieren durch einen 0,2-um Porengrße Filter in sterile Glasflaschen, in einer laminaren Strömung Schrank Lagerung bei 4 ° C Tabelle 3. Hefe Estrogen Screen – Assay; Herstellung und Lagerung von Minimalmedium und Medium – Komponenten. Vorbereitung und storage von 10x konzentrierter Hefekultur Am Tag 1 vorbereiten Wachstumsmedium (wie in 3.4.1 beschrieben) und in einen sterilen Erlenmeyerkolben gießen. Hinzufügen 125 ul 10fach konzentrierten Hefe aus Kryoröhrchen bei -20 ° C gelagert. Inkubieren des beimpften Medien bei 28 ° C für etwa 24 Stunden auf einem Rundschüttler. Am Tag 2 machen zwei Flaschen Wachstumsmedium (~ 50 ml) und gießen Sie in separate sterile Erlenmeyerkolben. 1 ml der 24-Stunden-Reinzuchthefe in jedem Kolben Wachstumsmedium. Inkubieren des beimpften Medien bei 28 ° C für etwa 24 Stunden auf einem Rundschüttler. Am Tag 3 gießen jede 24-Stunden-Kultur in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugation der 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C für 10 min bei 2.000 x g. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren jedes Pellet in 5 ml Minimalmedium mit 15% Glycerin. Machen Sie 0,5 ml Aliquots der 10-fach konzentrierter Hefekultur in 1,2 ml sterile Kryoröhrchen und bei -20 ° C für maximal 4 Monate. PrepaRation und Lagerung von chemischen Bestände für Standardkurven Spülen Sie alle Gläser und Spachteln zweimal mit absolutem Ethanol und lassen Sie vor dem Gebrauch trocknen alle Spuren von Verunreinigungen zu entfernen. Wiegen E2 direkt in ein Glasfläschchen in einem Pulver Wägekabine und stellen Volumenkonzentration in absolutem Ethanol. Verdünnt auf eine Konzentration von 2×10 -7 M (54,48 & mgr; g / L). Seal Deckel und lagern bei 4 ° C (in einem funkenfreien Kühlschrank). Assay Produzent Am Tag 0 Wachstumsmedium herzustellen. Die 45 ml Flasche Minimalmedium 5 ml Glucose-Lösung, 1,25 ml L-Asparaginsäure-Lösung, 0,5 ml Vitaminlösung, 0,4 ml L-Threonin-Lösung und 125 & mgr; l Kupfer (II) sulfat-Lösung. Gießen Wachstumsmedium in einen sterilen Erlenmeyerkolben. Hinzufügen 125 ul 10fach konzentrierte Stamm (abgetaut von -20 ° C Lagerung) in den Kolben und Inkubieren der inokulierten Medien bei 28 ° C für etwa 24 Stunden auf einem Rundschüttler. Am Tag 1 beschriften eine sterile 96-Well 'Verdünnungsplatte' und Reihenverdünnungen (100 ul – Volumina in Ethanol) von E2 Standardkurve und Testchemikalie (n) / Abwasser – Extrakt (s) (zB EE2) machen. Label-sterile 96-Well-optisch flachen Boden Mikrotiterplatte 'Assayplatte (n)'. Auf jeder Platte sind Rohlinge (plus / minus Lösungsmittel) und eine E2 Standardkurve, zusätzlich zu den Reihen der Testchemikalie (n) / Abwasser-Extrakt (n). Je 10 ul jeder Konzentration (E2, chemischen oder Extrakt) in die entsprechende Vertiefung der Testplatte. Je 10 ul Ethanol in jedem 'Lösungsmittel leer' Vertiefung der Testplatte. Lassen Testplatte mit dem Deckel aus bis zur Trockenheit verdampft. Machen Sie eine Flasche Wachstumsmedium (~ 50 ml) und mit 0,5 ml Chlorphenolrots-β-D-galactopyranosid (CPRG) -Lösung pro Flasche. Bestimme die Dichte der Hefezellen in der 24-Stunden-Kultur durch Trübung der Kultur bei 620 nm in einem Plattenlesegerät gemessen wird. Impfen die einssay Medium mit 4×10 7 Hefezellen aus dem 24 – Stunden – Kultur. Gießen geimpften Testmedium in einen sterilen Trog. Mit fügen Sie eine Mehrkanalpipette 200 ul geimpften Testmedium zu jeder Vertiefung der 96-Well-Assayplatte. Setzen Sie den Deckel auf der 96-Well-Assayplatte und die Ränder mit Klebeband. Schütteln Sie die Testplatte (n) 2 Minuten lang kräftig auf einer Titerplatte Schüttler und Inkubation bei 32 ° C in einem natürlich belüfteten Wärmeschrank. Am Tag 2, schütteln Sie die Testplatte (n) kräftig auf einer Titerplatte Schüttler für 2 min. Zurück zu 32 ° C Inkubator. Am Tag 4, schütteln Sie die Testplatte (n) 2 Minuten lang kräftig auf einer Titerplatte Schüttler. Lassen Sie die Platte (n) für ca. 1 Stunde ruhen lassen, dann lesen Sie die Testplatte (n) bei einer Absorption von 540 nm (optimale Absorption für CPRG ~ 575 nm) und 620 nm (für Trübung) einen Plattenleser. Lassen Sie Platte (n) bei Raumtemperatur und bei Bedarf später zu lesen. Östrogene Aktivität Berechnungen <ol> Korrekte Teststände für die Trübung der folgenden Gleichung: Korrekturwert = Probe oder Standard (E2) Absorption bei 540 nm – [Probe oder Standard (E2) Absorption bei 620 nm – leere Absorption bei 620 nm]. Plot E2 Standardkurve mit entsprechenden Rohlingen (für Kontamination zu überprüfen) 8. Verwenden Sie die korrigierten Probe (Extrakt oder chemisch) 'Estradiol-Äquivalente "zu berechnen. Verwenden Sie die aufgetragen E2 Standardkurve Werte und Regressionsgleichung (3-Parameter Polynom oder linear in Abhängigkeit von fit), um die Probe zu interpolieren / extrahieren Absorptionswerte zu E2 äquivalente Werte. Verwenden Konzentrationsfaktor (dh Wasser extrahiert und das Volumen von Ethanol der Extrakt wird erneut suspendiert in) östrogene Aktivität in der Probe vorextrahiertem zu berechnen. 4. Labor Based Assessment von östrogene Aktivität Mit In – vivo – Vitellogenin Induction in Male Elritze Verwenden männlich Elritze (Pimephalespromelas)> 4 Monate alt, die sekundären Geschlechtsmerkmale angezeigt werden (dh die Entwicklung von hochzeitlich Tuberkel und ein Rückenfettpolster), der männlichen Geschlechtsbestimmung. Zur Laichaktivität, getrennte reife Männchen 3 Wochen (± 3 Tage) vor dem Beginn des Tests zu verhindern. mindestens zwei 45-l-Glasaquarien mit einer maximalen Belastung von 3 g / l ein. Um eine ausreichende Anzahl von gesunden Fisch für den Test zu gewährleisten, verwenden ein Minimum von 100 Männern. Halten Sie die männlichen Fische unter gleichen Umweltbedingungen wie im Test erfahren werden (dh Wassertemperatur von 25 ± 1 ° C und einem 16: 8 Stunden Licht: Dunkel Lichtperiode). Aufrechterhaltung der Verdünnungswasserströmungsrate zu jedem Tank eine 95% Austauschzeit von 6 bis 8 Stunden mindestens alle zu gewährleisten, das heißt, 330 ml / min für eine 45 – Liter – Behälter. Prüfeinrichtung und experimentelles Design Verwenden Sie große Glasbehälter eine Beladung von bis zu 3 g Fisch aufzunehmen pro Liter water. Für 8 erwachsene Männer (nominell 4,5 g pro Stück), verwenden Sie einen 10 bis 20 L Tank. Verwenden Sie zwei Wiederholungstanks für jede Behandlung und schützen jeden Tank von unnötigen Sehstörungen (dh, verwenden Sie laminierte Karte Bildschirme zwischen den Tanks). Kennzeichnen Sie jeden Behälter mit einer Studie Nummer, eine Expositionskonzentration und einem Behälter-Identifikationsnummer. Für Abwasser anfällt, Studien Bei der Ankunft Transfer sofort Abwasser in einen Lagertank bei 10 ± 1 ° C. Beginnen Sie innerhalb von zwei Stunden nach Erhalt des Abwassers Dosierung Abwasser. Führen Sie das Abwasser über peristaltische Pumpe, aus dem 10 ° C Lagertank zu einem Akklimatisierung Gefäß. Erhitzen Sie das Abwasser in der Akklimatisierung Gefäß auf 18 ± 2 ° C. Pumpe den beheizten Ausfluß aus dem Gefäß Akklimatisierung an die Dosier- / Mischgefäße und dann auf den Testaquarien (die den Fisch hält). Erhitzen Sie die Aquarien auf eine Temperatur von 25 ± 1 ° C. Für die chemische Dosierung Studien Wiegen Testchemikalien in einem Pulver Wägekabine. Bereiten konzentrierten chemischen Bestände in ddH 2 O vorzugsweise ohne die Verwendung von Lösungsmitteln. Hinweis: Falls Lösungsmittel erforderlich sind, um Testverbindungen löslich zu machen, verwenden Lösungsmittelkontrollen zusätzlich zu der Verdünnungswasserregelung. Schwerkraftzufuhr oder Pumpe Verdünnungswasser von einer Temperatur gesteuert Verteilerbehälter über die Strömungssteuervorrichtung (en) zum Dosier- / Mischbehälter. Pumpe konzentrierte chemische Lager (n) eine peristaltische Pumpsystem zur Dosierung mit / Mischgefäße. Steuern Sie die Pumprate (von Lager chemisch) und Wasserdurchflussmenge (Verdünnungswasser), um die gewünschte Belichtungs Konzentration zu erreichen. Hinweis: Verwenden Sie Silikonschlauch Wasser / Test-Chemikalie zu jedem Testgefäß von der Dosier- / Mischbehälter zuzuführen. Verwenden , um eine Durchflussrate , die eine 75% Gefäßersatz in mindestens 24 Stunden zu liefern ausreichend ist, das heißt, 20 ml / min für eine 20 l – Tank. Pflegen Sie die Durchflussrate bei ± 10% des angegebenen Nennwert. </li> Aufrechterhaltung Belichtungstank Wassertemperatur bei 25 ± 1 ° C, gelöstem Sauerstoff über 70% des Luftsättigungswert (5,8 mg L -1 bei 25 ° C) und ± 0,5 pH – Einheiten (Ausgangs – pH zwischen 6,5 und 8,5) im gesamten Studie. Stellen Sie Lichtbedingungen Photoperiode von 16 Stunden Licht: 8 Stunden Dunkelheit, mit Morgen- / Abenddämmerung Übergangszeiten von 20 min. Füttern Sie die Fische zweimal täglich mit frisch aufgetauten gefrorenen erwachsenen Artemia (Artemia) bei 2,5 (± 0,1) g pro Behälter pro Feed. Auch die Fische zu füttern einmal täglich mit einer kleinen Menge (zwei Fingerklemm) eines tropischen Flocke Fischfutter. Lassen Sie mindestens 3 Stunden zwischen jedem Feed. Halten Sie eine tägliche Fütterung Aufzeichnung der Fütterung Antwort / Verhalten (gut, mittel oder schlecht, im Vergleich zu den Kontrollen) zu überwachen. Siphon die Tanks mindestens zweimal in der Woche (am besten täglich) alle Futterreste und Kot zu entfernen. Reinigen Sie die Seiten und Böden der Testgefäße mindestens einmal pro Woche. Nehmen Sie wöchentliche Wasserprobes aus jedem Tank östrogene Aktivität zu bestätigen (über Hefe-Bildschirm) und die chemische Zusammensetzung (über analytische Chemie). Siehe Abschnitte 1-3 Einzelheiten zur Wasserentnahme, Extraktion und Analyse. Anmerkung: Für jedes Experiment verwenden Verdünnungswasserregelung (negative Kontrolle), Positivkontrolle (E2 oder EE2) plus mindestens drei Verdünnungen von Abwasser (100, 50 und 25%) oder Prüfsubstanz Dosis-Reaktion zu überwachen. Wenn neue Technologien getestet werden, verwenden Verbindung / Abwasser mit oder ohne Behandlung (zB EE2 ohne Behandlung, EE2 mit TAML / Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) Behandlung 12; Abbildung 1). Abbildung 1. Diagramm darstellen experimentelle Gestaltung eines in vivo Dickkopfelritze vitellogenin Bioassay Entfernung von Ökotoxizität von 17α-Ethinylestradiol mit TAML / Peroxid – Wasserbehandlung zu bestimmen. Die experimental eingerichtet besteht aus acht 11-l-Glasaquarien jeweils gefüttert mit kontinuierlichen Fluss von Wasser. Einzelne chemische Stammlösungen und Wasser (gefiltert de-chlorierten) an die Mischkammern geliefert. Nominal – Konzentrationen (ohne Reaktion) in den Mischbehälter sind 2 ng / L EE2, 80 nM TAML und 0,16 g / LH 2 O 2. Chemische Stammlösungen (EE2, H 2 O 2 und TAML) hergestellt und separat dosiert , so dass die Reaktionen in den Mischbehälter beginnen. Fisch (8 männlich Elritze pro Tank) werden dem Gemisch ausgesetzt (n) nach einer Reaktionskontaktzeit von ca. 45 Minuten. Wasserproben werden von den Belichtungstanks wöchentlich genommen. Die Plasmaproben werden von Elritzen getroffen, um die östrogene Biomarkers vitellogenin (VTG) von einer Basisgruppe zu messen, zu Beginn der Studie und alle anderen Fische nach 21 Tagen nach der Exposition. Die spezifischen Behandlungen sind: '-C'; Negativkontrolle (Verdünnungswasser), '+'; positive Kontrolle von EE2,'+ H'; EE2 plus H 2 O 2, '+ T'; EE2 plus H 2 O 2 plus TAML. Diese Zahl wurde von Mills et al modifiziert. 2015 12. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Testprozedur Akklimatisierungszeit Messen Sie Nassgewicht (g) jeder geschlechtsreifen männlichen Fische, und weisen nach dem Zufallsprinzip zu jedem Tank (8 Männer pro Tank). Halten Sie nicht zugeordneten Fisch aus der gleichen Charge und halten sie unter den gleichen Testbedingungen. Verwenden Sie diese Fische keine Personen zu ersetzen, die während des Zeitraums von 7 Tagen Akklimatisierung Anzeichen von körperlichen Schäden oder fehlenden Zustand zeigen. Stellen Sie sicher, am Ende der Eingewöhnungszeit jeder Behandlungstank hat 8 Männer, die auf den Testbedingungen vollständig akklimatisiert haben. Nehmen Sie 'Baseline' Plasmaproben von zusätzlichen 8 männlichen Patienten aus der gleichen batch von männlichen Fischen. Folgen Sie der Blutentnahme Verfahren in Abschnitt 4.4 und die Vitellogenin (VTG) Analyseverfahren 4.5. Nach der Eingewöhnungszeit, liefern Abwasser oder Chemikaliendosierung Beständen an die Belichtungstanks für 21 Tage unter 4.2.2 oder 4.2.3 beschrieben. Monitor Mortalität, Verhalten und Aussehen der Fische in jedem replizieren Tank täglich vor der ersten Einspeisung des Tages. Nehmen Sie jeden anormales Verhalten oder Vorfälle. Hinweis: Stellen Sie sicher, Umgebungsbedingungen und Fütterung Raten Erhaltung der Gesundheit der Fische (Abschnitte 4.2.4 und 4.2.5). Fisch-Probenahme nach 21 Tagen Expositionszeit 12 Stunden vor der Probenahme, stoppen Sie die Fische füttern. Label-Mikrozentrifugenröhrchen für die Entnahme von Blutproben, fügen ~ 5 ul Aprotinin (ein Protease-Inhibitor) und legen sie auf Eis. Machen Sie eine 500 mg / l-Lösung von MS222 (Betäubungsmittel) durch Auflösen von 500 mg MS222 pro 1 l de-gechlortes Wasser (vorher akklimatisiertauf 25 ± 1 ° C). Neutralisieren des MS222 auf pH 7,4 ± 0,4 unter Verwendung von 1 M NaOH. Bewegen jeder Fisch aus dem Tank in die gepufferte MS222. Halten Sie in der Lösung bis zur Einstellung aller operculum Bewegung (in der Regel 5 ± 1 min). Messen Sie und die Gabellänge (mm) unter dem Terminal Anästhetikum aufzunehmen. Verwenden Sie eine Einweg – Skalpell den Schwanz amputiert werden , und die Verwendung einer heparinisierten hemocrit Rohr das Blut aus der Schwanzarterie (Abbildung 2) zu sammeln. verzichten Sie vorsichtig das Blut in den voretikettierten Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten. Töten Sie den Fisch sofort nach der Blutentnahme. Bestätigen Sie den Tod durch die endgültige Einstellung der Zirkulation und / oder die Zerstörung des Gehirns. Zu messen und aufzuzeichnen Gewicht Gesamt Fisch (bis nächsten 0,01 g) und sezieren Gewebe nach Bedarf. Zentrifugieren Sie das Blut (7000 × g für 5 Minuten bei 4 ° C) innerhalb von 2 Stunden der Sammlung. Übertragen Sie die Plasmaüberstand mit einer Pipette in neue markierten 0,4 ml Reaktionsgefäße mites und auf Eis lagern. Frieren Sie die Röhrchen mit Plasma auf Trockeneis innerhalb von 30 min Zentrifugation und bei -80 ° C vor der Analyse von Plasma-VTG-Konzentrationen. Abbildung 2. Fotos zeigt männliche Dickkopfelritze (Pimephales promelas), Plasma – Sammlung und Lage der Hoden. Am Ende der Belichtung von 21 Tagen alle Fische sollten Blutproben zu sammeln getötet werden. Sobald unter diesem Anschluss Anästhetikum Fischlänge (Gabellänge, mm) gemessen werden sollte, schnell gefolgt von der Blutentnahme aus der Schwanzarterie Photo-A: Rot . Gepunktete Linie zeigt Lage für Schwanz Amputation (ein Einweg – Skalpell verwendet werden sollte , den Schwanz amputieren ). Foto-B zeigt ein heparinisiertes hemocrit Rohr verwendet , um das Blut zu sammeln. Jeder Fisch sollte dann sofort getötet werden, nachdem seine Blutprobe in diesem Fall getroffen wurde, der ganze Kopfwurde aus dem Körper (Photo-C) abgetrennt. Sobald der Fisch getötet wurde, kann der Körperhöhle, die inneren Organe zu offenbaren geöffnet werden. Foto-C zeigt die Lage des Hodens (Gonaden) in Bezug auf die Schwimmblase (SB) in Cypriniden, zB Dickkopfelritze, Rotauge, Karpfen usw. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Messen Sie Plasma VTG-Konzentrationen mit einer homologen VTG Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) Kit speziell für Elritze entworfen. Bereiten VTG Standards und Puffer wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Verdünnte Plasmaprobe 01.50, 1: 5000 und 1: 500.000 und testen sie in zweifacher Ausfertigung zu erhalten Lesungen des VTG-Standardkurvenbereich nach Herstellerangaben. Folgen Sie Herstellerrichtlinien vitellogenin Konzentrationen zu berechnen. </li> 5. Feldprüfungen von Advanced / Neuartige Abwasserreinigung Technologien zur Milderung östrogene Aktivität Mit In – vivo – Vitellogenin und Intersex Induction in Roach (Rutilus rutilus) Erfassung von wilden Rotauge leben stromabwärts Kläranlage Vorfluter Hinweis: Verwenden Sie Plötze (Rutilus rutilus) oder andere reichlich Süßwasser oder Brackfischarten, die gonochoristic und bekannt sind empfindlich gegen östrogene Störungen des Hormonsystems zu sein. Fische fangen mit electro, Netting, Trapping oder anderen anerkannten Fangmethoden je nach Situation 13. Transportieren Sie den Fisch in belüfteten Tanks zurück zu Labor für Probenahme. Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen, wie in 4.4.2 beschrieben. Prepare MS222 gepuffert, wie in 4.4.3 beschrieben. Anesthetize Fisch wie in 4.4.4 beschrieben. Messen Sie Fisch Länge und Gewicht unter Klemme Narkose. Sammeln Sie Blut aus der Schwanzarterie mit dispoZobel heparinisierten Spritze. Töten Sie jeden Fisch unmittelbar nach der Blutentnahme. verzichten Sie vorsichtig das Blut in vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis halten. Bereiten Sie Plasma, wie in Schritt 4.4.7 und messen die VTG durch ELISA (4.5) beschrieben. Mit einer Pinzette 2-3 Fischschuppen von jedem Fisch entfernen und einzeln beschriftet kleine Papierumschläge platzieren. Bewahren Sie Umschläge bei Raumtemperatur unter trockenen Bedingungen für eine spätere Fischaltersbestimmung und Wachstumsanalyse. Offene Körperhöhle mit einem Skalpell die inneren Organe zu offenbaren. Nehmen Sie den Darm, um die Schwimmblase mit einem Gonaden auf beiden Seiten (Abbildung 2) zu offenbaren. Entfernen Sie vorsichtig die paarigen Gonaden mit feinen nosed Zange aufnehmen und in ein Glasfläschchen. Decken Sie die Gonaden mit Bouin-Fixiermittel in einem Verhältnis von 1:10 Gewebe: Fixativ. Lassen Sie das Gewebe in Bouin-6-24 h in Abhängigkeit von der Größe des Gewebes (Fixiermittel bei 1 mm pro Stunde durchdringt). Einmal festgelegt, gießen Sie die Bouin-Fixiermittel ein Offd mit 70% technischem Brennspiritus (IMS) zu ersetzen. Lagern Sie das fixiertem Gewebe bei Raumtemperatur bis Gewebe für die Histopathologie (Abschnitt 5.3) verarbeitet werden. Feldbasierte Bewertung von östrogene Aktivität unter Verwendung von in vivo vitellogenin und Intersex – Induktion in Rotauge Experimentelles Design und Aufbau Hinweis: die Tanks und Pilotanlage im Vorfeld der in – vivo – Arbeitsbeginn ein. Starten Sie die Tanks 3-4 Wochen vor jeder Zugabe von Fisch in das System fließt. Monitor – Wasserdurchflussraten, Wasserqualität und Bedingungen (pH – Wert, Temperatur, gelöster Sauerstoff, etc.) regelmäßig sicher , dass Parameter zu machen aufrechterhalten werden kann. Construct großen Tanks (zB 300-1000 L) vor Ort an der Pilotanlage, die erhalten können "Kontrolle" de-chloriertem Leitungswasser, Standard behandelte Abwasser (n) und Advanced behandelte Abwasser (s) parallel. Bringen Sie Luftpumpe / Belüfter in die Tanks. Set Wasserdurchflussraten von mindestens 6 Tank v zu erreichenolume Austausch pro Tag. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Tanks gut isoliert sind und im Schatten zu hohe tägliche Temperaturschwankungen zu verhindern. Design tanks Beobachtung der Fische, für Verhaltensänderungen (mangelnde Ernährung, etc.), Krankheitsanzeichen und Mortalität zu ermöglichen. Starten Sie die Belichtung durch die Taschen von Rotaugen schwimmend (von der Fischfarm) in den jeweiligen Tanks für 1 Stunde. In Tank Wasser in die Taschen nach und nach, bis die Wassertemperatur und Bedingungen sind Umgebungs. Lassen Sie die Fische in ihre Tanks. Feed-Erwachsenen Rotauge täglich auf Fischfutter (Größe 0,5-0,8). Feed – juvenile Rotauge täglich auf kleinen pelletiert (Pelletgrößen 100-300) nicht-östrogene Futter 14 ad libitum, auf der Grundlage von uneaten Futter angepasst. Halten Sie eine tägliche Fütterung Aufzeichnung Dokumentieren Fütterung Antwort / Verhalten (gut, mittel oder schlecht, im Vergleich zu den Kontrollen). Nehmen Sie wöchentliche Wasserproben aus jedem Tank östrogene Aktivität und chemische Zusammensetzung zu bestätigen. See Abschnitte 1-3 für Details von Wasser Probenahme- und Analyseverfahren. Histopathologie der Fisch Gonaden 15 Entfernen Sie vorsichtig die seziert und fixiert Gonaden aus dem Behälter mit einer Pinzette und auf einem Schneidebrett (5.1.6 und 5.1.7 in den Schritten beschrieben). Verwenden Sie ein Mikrotom-Klinge jedes Gonaden in 3 Teile zu schneiden (anterior, Mitte und posterior) und von jedem Teil geschnitten, um eine 3-5 mm dicken Querschnitt. Vorsichtig alle sechs Stücke in eine Plastik Biopsie Kassette markiert, aufnehmen und in Gewebeprozessor die Zeiten in der Tabelle 4 aufgeführt werden. Wax einbetten Gewebe und Abschnitt auf Rotationsmikrotom (3-5 & mgr; m). Transferabschnitte an markiertes bioadhäsiven beschichteten Glasobjektträger und die Objektträger auf einer erhitzten Platte (eingestellt auf 45 ° C) für 24 Stunden zu trocknen. Stain die Folien, entweder manuell oder ein automatisiertes stainer verwenden, mit Hilfe der detaillierten Timings in Tabelle 5. Geben Sie einen Tropfen Befestigungsmittel auf dem gefärbten Gewebe und lay Deckglas ein Glas mit der Montagemittel über das Gewebe zu schützen. Zunächst untersuchen jede Folie bei geringer Vergrößerung (20X, dh 2x Objektiv mit 10fach Auge Linien Vergrößerung) Geschlecht und die Anzahl der Punkte von Anlagen zur Körperhöhle 15 zu bestimmen. Notieren Sie alle Abweichungen für jeden Fisch. Bei einer höheren Vergrößerung (100X oder 400X), untersuchen das Gewebe gametogenesis Stadien, Anomalien und die Anwesenheit von Eizellen in Hodengewebe zu beurteilen. Notieren Sie sich die Schwere der Intersex das folgende Bewertungssystem unter Verwendung von 0 (normale männliche Gewebe) bis 7 (100% Ovargewebe) 6 (siehe Tabelle 6). Schrittnummer Behandlung Zweck Zeit (hr) 1 70% IMS Entwässerung 3 2 90% IMS Entwässerung 2.5 3 95% IMS Entwässerung 1.5 4 100% IMS Entwässerung 1.5 5 100% IMS Entwässerung 1.5 6 100% IMS Entwässerung 1.5 7 100% IMS Entwässerung 1.5 8 Histologie der Clearingstelle, Clearing 1.5 9 Histologie der Clearingstelle, Clearing 1.5 10 Histologie der Clearingstelle, Clearing 1.5 11 WACHS Wachs-Infiltration 1,25 12 WACHS Wachs-Infiltration 1,25 20 Stunden TOTAL Tabelle 4. Verarbeitungssystem für Wachs Gewebe für die Histopathologie imprägniert wird . Die Gewebe sollte in einem automatischen Gewebeprozessor verarbeitet werden. Gewebe sind in den Lösungen für die Zeitdauer angegeben detailliert eingetaucht werden. Stain – Nr. Fleck Zweck Zeit (min) 1 Histologie Clearing Agent Löst Wachs 15 2 <td> 100% IMS Trink 2 3 90% IMS Trink 2 4 70% IMS Trink 2 5 TAP WATER (RUNNING) Spülen 2 6 Hämotoxylin Stains Zellkerne blau 10 7 TAP WATER (RUNNING) überschüssiges 10 8 Aufgesäuerte IMS Entchlorung 20 sec 9 TAP WATER (RUNNING) Spülen 20 sec 10 LiCO 3 Salz 20 sec 11 TAP WATER (RUNNING) Spülen 20 sec 12 1% Eosin (wässerig) Stains Zytoplasma rosa 20 sec 13 TAP WATER (RUNNING) überschüssiges 5 14 70% IMS Entwässerung 2 15 90% IMS Entwässerung 2 16 100% IMS Entwässerung 5 17 Histologie Clearing Agent Entfernen IMS, Bindemittel 5 Tabelle 5. Lösungen und Eintauchzeiten für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung von Fisch Gonaden – Gewebe. Die Objektträger sollten in jedem Bad für die alloc platziert werdenATED Mal in Folge. H & E-Färbung von Gewebe erforderlich ist auf Fisch Gonaden Entwicklungs- oder organisatorischen Auswirkungen von östrogene Abwässern zu bestimmen. Ergebnis Abschnitt Beschreibung 0 Normale männliche Hoden 1 Multifocal Ovotestis mit 1-5 Oozyten (in der Regel einzeln) unter dem Hodengewebe verstreut 2 Multifocal Ovotestis, 6-20 Eizellen oft in kleinen Gruppen unter dem Hodengewebe verstreut 3 Multifocal Ovotestis, 21-50 Oozyten in Clustern 4 > 50 und <100 Oozyten. Abschnitt ist in der Regel multifokale und hat das Aussehen eines Mosaiks von Testicular und Eierstockgewebe. 5 > 100 Eizellen, in der Regel multifokale aber auch mit deutlich erkennbaren Zonen von Eierstock- und Hodengewebe getrennt aus dem Hodengewebe Schwerpunkt sein könnte. 6 > 50 Prozent des Gonadengewebe auf dem Abschnitt ist Eierstock- und eindeutig aus dem Hodengewebe von Epithelzellen und phagozytischen Gewebe getrennt ist. 7 100 Prozent der Gonadengewebe auf dem Abschnitt ist ovarian. Tabelle 6. Scoring – System Schwere der Intersex – Zustand in Rotauge zu beurteilen. Histologisch Präparate von Gonadengewebe sollte unter dem Lichtmikroskop untersucht werden, bei 20X, 100X und 400 – facher Vergrößerung, Anomalien und die Anwesenheit von Eizellen in Hodengewebe zu beurteilen. Diese Tabelle wird von Iobling modifiziert <em> et al. 2006 6.