排水処理プロセスの有効性の評価のための化学的および生態毒性メソッドのバッテリーの使用は、エストロゲン効力を削除します

倫理の声明：魚中の化学物質/混合物の内分泌かく乱作用を評価するためのプロトコルは、法律1986ブルネル大学、ロンドンの動物福祉によっておよび倫理審査機関（AWERB）と動物の下で英国内務省（科学的手順）によって承認されています。 1.水のサンプル収集、保存と抽出サンプルの収集と保存使用前に、適切な界面活性洗浄剤でボトルをきれいに。洗浄後、水、排水、乾燥してボトルをすすぎます。 硝酸銅（II）0.5gを注入し、6ml 3.6 M塩酸溶液からなる保存剤を含有する2リットルの容量のガラス瓶にサンプルを収集します。 10°C以下の店舗サンプル。抽出し、収集と保存、次できるだけ早く分析します。 （ステロイドエストロゲン分析用）サンプルの抽出とクリーンアップ10 固相抽出（SPE） 抽出前に、1μmの孔径のろ紙を用いて浮遊物質、濾過水サンプルを低減します。 2,4,16,16-d 4が-17βエストラジオール（E2）：一度濾過し、2,4,16,16-dの4 -エストロンを含む重水素化内部標準原液をスパイク100μlを加えることにより、内部標準とサンプルをスパイク：下水のための2 ngの/ Lの内部スパイクをもたらし、2,4,16,16-dの4-17αエチニルエストラジオール（EE2）（すべてのメタノール中の40μg/ Lがで）千ミリリットルの流出物（または100ミリリットル流入）へ流出液サンプル、汚水流入サンプルの20 ngの/ Lの。 SPE装置に使い捨てのバルブライナー、スチレンジビニルベンゼンSPEカートリッジ、およびカートリッジリザーバーを取り付けます。機器をテストするための真空ポンプ上のスイッチが適切に密閉されています。 ピペット各リザーバに酢酸エチル5mlを、カートリッジを調整します。 （毎分10ml未満の流量を可能にするために10 inHg下に）真空ポンプのスイッチを入れますそして、液体を介して引き出します。 SPEカートリッジを乾燥させないでください。 5mlの水に続いてメタノール5mlと繰り返しプロセス。 水で各カートリッジリザーバを補充し、カートリッジの貯水池やガラス製サンプル瓶の間に1/8 "PTFEチューブを接続します。毎分未満10ミリリットルの流量で真空に切り替え、試料全体がカートリッジを通過することを可能にします。必要に応じて、廃棄物のフラスコを空にします。 徹底的に（ 例えば、暗褐色から淡褐色に）色を変更する真空下でのカートリッジの内容まで（空気または窒素を使用するか）SPEカートリッジを乾燥させます。 抽出マニホールドの内部でラックと場所に清潔で乾燥した10mlのガラスコレクションバイアルを置きます。各ライナーがバイアルの上にあることを確認してください。ピペット8真空ポンプ（毎分未満10ミリリットルの流量）の各サンプル容器にジクロロメタン、スイッチのミリリットルとはを通じて収集バイアルに液体を引っ張ります。 SPEマニホールドから10ミリリットルバイアルを削除しますそして1ミリリットルにボリュームを減らすために、コンセントレータを使用しています。オートサンプラーバイアルに各サンプルを転送し、さらに窒素ブローダウン装置を使用して100μlに集中します。 ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）清掃 表1に記載の条件を用いたGPC備えたHPLCに溶出試料抽出物の95μLを注入する。GPCは、コンセントレータと窒素装置をブローダウンした後、ヘキサンで2.0ミリリットルを構成するを使用して200μlにダウンして抽出し濃縮します。 SPEクリーンアップ SPEマニホールドに使い捨てバルブライナー、アミノプロピルカートリッジ、およびカートリッジリザーバーを取り付けます。抽出マニホールドの内部でラックと場所に清潔で乾燥した10mlのガラスコレクションバイアルを置きます。ピペット各リザーバにヘキサン2mlを、カートリッジを調整します。液体がカートリッジを通過することを許可します。 リザーバにGPC試料抽出物をピペットし、再び液体に許可カートリッジを通過します。バイアル中のサンプルの溶出液を収集し、マニホールドから取り外します。溶出液は捨てないでください。 ラックに新しい乾いた清潔な10ミリリットル収集バイアルを入れ、抽出マニホールドの内側に配置します。カートリッジを洗浄容器にヘキサン（30％v / v）の中の酢酸エチル2 mLを加え、カートリッジから液体を引きます。すべての洗浄液を廃棄し、ヘキサン中の酢酸エチルの更なる2mlで繰り返します。 逆抽出マニホールド内部のラックに元の10ミリリットル収集バイアル（ステップ1.2.3.2）を配置します。ピペットアセトン中の酢酸エチル2mlの（50％v / v）のリザーバに、真空ポンプのスイッチを、バイアル中を通る液体を引く（2 inHg毎分2ml未満の流量を可能にするために、次へ） 。酢酸エチルの別の2mlで処理を繰り返します。 サンプルバイアルを取り外し、1ミリリットルに抽出量を削減するためにコンセントレータを使用しています。トン蒸発させるために、機器をダウンブロー小さいガラスバイアルに試料を移し、窒素を使用彼は初期の乾燥に抽出します。 メタノール100μLを加え、よく混ぜます。 （0.3ミリリットルインサート付き）オートサンプラーバイアルに抽出液を移し、バイアルをキャップ。 LCMS / MSを使用してサンプルを分析する（セクション2を参照）。 カラム： PLゲル、50 A、300×7.5ミリメートル、5ミクロン ガードカラム： PLゲル、50×7.5ミリメートル、5ミクロン 移動相： ジクロロメタン 流量： 毎分1ミリリットル カラム温度： 25°C UV検出器： 210 nmの 注入量： 95μlの 注入モード： スタンドアード スピードを描きます： 毎分500ミリリットル スピードを取り出します： 毎分500ミリリットル 位置を描画： 3ミリメートル 画分を集めました。 3ミリリットル画分（7から10分）10ミリリットルバイアル中 表1の条件と抽出された廃水試料のゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）のクリーンアップのためのパラメータ表は、GPCカラム、移動相、温度、注入量、および検出器の波長を詳しく説明します。 （酵母エストロゲン画面用）サンプル抽出セクション1.2.1.1で詳述されるようにフィルタサンプル。 SPE装置に使い捨てのバルブライナー、C18 SPEカートリッジ、およびカートリッジリザーバーを取り付けます。機器をテストするための真空ポンプのスイッチを入れるには、適切に密閉されています。 各リザーバにピペット5mLのメタノール、Cを調整します18のカートリッジ。 （毎分約5ミリリットルの流れを可能にするために約5 inHgに）真空をオンにしてから液体実行させ、1〜分間の半分の方法を一時停止。カートリッジは、乾燥させないでください。 HPLCグレードまたは再蒸留水（のddH 2 O）のいずれかでの繰り返し処理。再びドライ実行しないでください。 セクション1.2.1.4で説明したように水のサンプルを抽出します。徹底的にカートリッジを乾燥させるために、少なくとも30分間真空を続けます。 抽出マニホールド内のラックにきれいな乾いた10ミリリットルのコレクションバイアルを置きます。各ライナーがバイアルの上にあることを確認してください。各リザーバにメタノール5mlを追加します。真空（5ミリリットル/分の最大流量）をオンにして、液体がバイアルにカートリッジを通過できるように、2〜分間の半分の方法を一時停止。 YESの画面を使用して分析する前に、窒素を使用して初期乾燥するまで抽出物を低減し、500-1,000μlのエタノールを用いて再構成します。蒸発を避けるために、サンプルバイアルの蓋を密封し（4℃で維持スパーク・フリー冷蔵庫）。 LCMS / MSを使用した2化学分析製造元の指示を用いてLCMS / MSシステムの動作条件を最適化します。 液体クロマトグラフィーおよび質量分析条件を用いてキャリブレーション標準液、サンプルを抽出し、空白と分析品質管理（AQC）のサンプルを分析し、 表2に詳述されるようにイオン遷移を監視します。内部使用して、サンプル抽出物中のステロイドエストロゲンの濃度を決定します規格10。 LCMS 液体クロマトグラフィーカラム： C18（2）、150×4.6 mmの5ミクロン。 注入量： 20μlのフロー： 毎分0.5ミリリットル。 Mobileフェーズ： 溶媒A：0.1％アンモニアを含む水。 溶媒B：アセトニトリル。 勾配プログラム： 時間（分） 0 10 18 24 28 A：B溶剤比 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00 質量分析ソース： エレクトロ（マイナスイオン） ガスソース： CUR：20 psiで、GS1：70 psiで、GS2：30のpsi TEM：600°C、CADガス5とイオンスプレー電圧-900 MRMトランジション： </td> E1： 145分の269＆143分の269 E2： 145分の271＆143分の271 EE2： 145分の295＆143分の295 E1-D4： 147分の273 E2-D4： 147分の275 EE2-D4： 145分の299 廃水抽出物中のステロイドエストロゲンのLCMS / MS分析のために表2の詳細なパラメータ及び条件表は、サンプル注入量を与え、流速、移動相条件AND勾配。 インビトロ酵母エストロゲン画面で使用3.エストロゲン活性（YES）アッセイ8 準備し、（a）〜（g）の表3の通り最小培地および培地成分を格納します。 （a）最小培地（pHは7.1）： Fe 2を40mgを添加することによっての Fe 2（SO 4）3溶液（SO 4）二回蒸留水（のddH 2 O）の3〜50ミリリットルを準備 2Lのガラスビーカーに1LののddH 2 Oを加えますビーカーに以下のコンポーネントを追加します。 13.61グラムのKH 2 PO 4 1.98グラム（NH 4）2 SO 4 4.2グラムのKOH 0.2グラムのMgSO 4 Fe 2（SO 4）1mlの<sub>の3溶液 50ミリグラムのL-ロイシン 50mgのL-ヒスチジン 50 mgのアデニン 20mgのL-アルギニン塩酸 20mgのL-メチオニン 30mgのL-チロシン 30mgのL-イソロイシン 30mgのL-リジン塩酸 25ミリグラムのL-フェニルアラニン 100mgのL-グルタミン酸 150ミリグラムのL-バリン 375ミリグラムのL-セリン磁気フリーで加熱撹拌機にビーカーを入れて、それがすべて溶解するまで撹拌します pHが7.1であることを確認し、必要に応じて調整 50ミリリットルの無菌注射器は、金属ねじのトップ蓋付きガラス瓶に45ミリリットルのアリコートを分配使い方オートクレーブ中で10分間、121℃で最小培地を滅菌します室温で保存 （b）のD – （+） -グルコース： ddH 2 O中の20％のw / v溶液を調製金属ネジの上部の蓋付きガラスバイアルにに20ミリリットルのアリコートを分注しますオートクレーブ中で10分間121℃でグルコース溶液を滅菌室温で保存 （C）L-アスパラギン酸： ddH 2 O中に4mg / mlのストック溶液を作ります金属ネジの上部の蓋付きガラスバイアルにに20ミリリットルのアリコートを分注しますオートクレーブ中で10分間121℃でL-アスパラギン酸溶液を滅菌室温で保存 （d）のビタミンソリューション： ddH 2 O 100mlにビオチン2ミリグラムを添加することによってビオチン溶液を調製 8 mgのチアミン、8mgのピリドキシン、8 mgのパントテン酸、40mgのイノシトールを量り分けます。すべての乾燥成分を追加し、180ミリリットルのビオチン溶液の20ミリリットルのddH 2 O 層流キャビネット内で、滅菌ガラスボトルに0.2μmの細孔サイズの使い捨てフィルターを通して濾過することにより、10ミリリットルの滅菌アリコートを作ります 4°Cで保存 （E）L-トレオニン。 ddH 2 Oに24 mg / mlでのL-スレオニンの100ミリリットルを準備金属ネジの上部の蓋付きガラスバイアルにに10ミリリットルのアリコートを分注しますオートクレーブ中で10分間121℃でL-スレオニン溶液を滅菌室温で保存<st栄>（F）硫酸銅（II）： ddH 2 O中20mM硫酸銅（II）溶液25mlを準備クリーンベンチ内で、滅菌ガラスボトルに0.2μmの孔径のフィルターを通して濾過することにより5ミリリットル滅菌アリコートを作ります室温で保存 （g）のクロロフェノールレッド-β-D-ガラク（CPRG）： ddH 2 OにCPRGを10mg / mlの溶液25mlを調製クリーンベンチ内で、滅菌ガラスボトルに0.2μmの孔径のフィルターを通して濾過することにより5ミリリットル滅菌アリコートを作ります 4°Cで保存 表3 酵母エストロゲンスクリーンアッセイ;最小培地および培地成分の調製及び保管。 準備とストラ10倍に濃縮酵母培養のGE 1日目に、増殖培地を準備する（3.4.1に詳述）と、滅菌三角フラスコに注ぎます。 -20℃で保存した極低温バイアルから10倍に濃縮酵母の125μLを加えます。オービタルシェーカー上で約24時間、28℃で接種したメディアをインキュベートします。 2日目に、成長培地（〜50ミリリットル）の2つのボトルを作成し、個別の無菌コニカルフラスコに注ぎます。増殖培地の各フラスコに24時間培養した酵母の1ミリリットルを追加します。オービタルシェーカー上で約24時間、28℃で接種したメディアをインキュベートします。 3日目に、滅菌した50mlの遠心管に各24時間の文化を注ぎます。遠心2,000 X gで10分間4℃で50mlチューブに。上清を捨て、そして15％グリセロールを含む最少培地5ml中に各ペレットを再懸濁します。 4ヶ月の最大のために-20℃で1.2 mlの滅菌クリオバイアルや店舗で10倍濃縮された酵母培養液0.5mlのアリコートを行います。 Prepa標準曲線のための化学株式の比率とストレージ無水エタノールで二回、すべてのガラス製品やヘラをすすぎ、汚染物質の痕跡を除去するために、使用前に乾燥させるために残します。 粉末計量キャビネット内のガラスバイアルに直接E2を計量し、無水エタノール中の体積濃度を調整します。 2×10 -7 M（54.48μgの/ L）の濃度に希釈します。シール蓋とストア4℃で（スパーク・フリー冷蔵庫の中）。 アッセイプロデューサー 0日目に、増殖培地を準備します。最少培地45mlのボトル5 mlのグルコース溶液1.25 mLのL-アスパラギン酸溶液を0.5mlのビタミン溶液0.4 mlのL-スレオニン溶液、および125μlの硫酸銅（II）溶液を加えます。滅菌三角フラスコに成長培地を注ぎます。 フラスコに（-20℃の保存から解凍）10倍濃縮ストックの125μlを添加して、オービタルシェーカー上で約24時間、28℃で接種したメディアをインキュベートします。 1日目に、滅菌96ウェルの「希釈プレート」を標識し、E2標準曲線と試験化学物質（複数可）/廃液の抽出物（複数可）（ 例えば 、EE2）の連続希釈液（エタノール中の100μlのボリューム）を作ります。 ラベル滅菌96ウェルの光学平底マイクロタイター」アッセイプレート（複数可）」。すべてのプレート上で試験化学物質（複数可）/廃液の抽出物（複数可）の行に加え、空白（プラス/マイナス溶媒）およびE2標準曲線が含まれます。 ピペットアッセイプレートの適切なウェルに各濃度の10μlの（E2、化学的または抽出物）。ピペットアッセイプレートの各「溶媒ブランク」ウェルにエタノール10μlの。乾燥するまで蒸発させるために蓋をオフにしてアッセイプレートを残します。 成長培地（〜50ミリリットル）のボトルを作成し、ボトルあたりクロロフェノールの0.5ミリリットル赤-β-D-ガラク（CPRG）ソリューションを追加します。プレートリーダーで620 nmにおける文化の濁度を測定することにより、24時間培養中の酵母細胞の密度を決定します。 Aを接種します24時間の培養物から4×10 7酵母細胞とssay培地。 無菌トラフに接種アッセイ培地を注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルアッセイプレートの各ウェルに接種し、アッセイ培地200μlを加えます。 96ウェルアッセイプレートに蓋を入れ、テープで縁をシール。タイタープレートシェーカー上で2分間激しくアッセイプレート（複数可）をシェイクし、自然換気暖房キャビネット内で32℃でインキュベートします。 2日目に、2分間、タイタープレートシェーカー上精力的にアッセイプレート（複数可）を振ります。 32℃のインキュベーターに戻ります。 4日目に、タイタープレートシェーカー上で2分間激しくアッセイプレート（複数可）を振ります。プレートリーダーを用いて（濁度）を540nm（CPRG〜575 nmのための最適な吸光度）の吸光度と620 nmでアッセイプレート（複数可）を読んで、その後約1時間放置し、プレート（複数可）のままにしておきます。室温でプレート（複数可）し、必要に応じて、後で読みのままにしておきます。 エストロゲン活性の計算<オール> – [サンプルまたは標準（E2）620 nmの吸光度 – 620 nmでのブランク吸光度]補正値=サンプルまたは540 nmでの標準（E2）の吸光度：下記の式を用いて濁度の正しいアッセイの測定値。 （コンタミネーションをチェックする）適切なブランクがプロットE2標準曲線8。 「エストラジオール同等物 'を算出するために補正されたサンプル（抽出物または化学的）を使用します。 /サンプルを補間E2同等の値に吸光度値を抽出するためにプロットされたE2標準曲線値と回帰式（3-パラメータ多項式または線形フィットに応じて）を使用します。使用濃度因子（ すなわち 、水抽出とエタノールの体積抽出物に再懸濁される）前抽出されたサンプルにエストロゲン活性を計算します。 男性ファットヘッドミノーにおけるインビボビテロジェニン誘導で使用してエストロゲン活性の4研究室ベースのアセスメント男性のファットヘッドミノー（Pimephalesを使用しますpromelas）>第二次性徴を（表示する旧4ヶ月、 すなわち 、婚姻結節の開発と男性の性的決意を示す背fatpad）。 産卵活動を防止するために、事前のテストの開始に成熟した男性3週間（±3日）を分離。 3グラム/ Lの最大積載して、少なくとも2 45リットルのガラス水槽をセットアップします。テストのために健康な魚の十分な数を確保するために、100人の男性の最小値を使用します。 テストで経験されるように、同一の環境条件の下で男性の魚を保つ（ すなわち 、25±1℃の水温および16：8時間の明：暗の光）。 すなわち 、少なくとも毎に6~8時間、95％の交換時期を確実にするために、各タンクに希釈水の流量を維持し、45 Lタンク330 ml /分。 試験装置および実験デザインワット1リットルあたりの魚の最大3グラムの荷重に対応するために、大きなガラスの水槽を使用してえー。 8成人男性（公称4.5グラムずつ）について、10-20 Lタンクを使用します。 各治療のために2つのレプリカのタンクを使用し、不要な視覚障害から各タンクを保護する（ すなわち、タンク間ラミネートカード画面を使用）。研究番号、暴露濃度と容器識別番号で各タンクを特定します。 流出廃水の研究のために到着時に、直ちに10±1℃での貯蔵タンクに廃液を転送します。流出物の受領後2時間以内に流出物を投与開始します。 馴化容器に10℃の貯蔵タンクから蠕動ポンプを介して、流出物を供給。 18±2℃に順化容器内の廃液を加熱します。投薬/混合容器に順化容器から温排水をポンプしてから（魚を保持している）試験水槽へ。 25±1℃の温度に水槽を熱し。 化学投薬研究のため粉末計量キャビネットに試験化学物質を秤量します。好ましくは溶媒を使用せずのddH 2 O中濃化学株式を準備します。 注意：溶剤は、試験化合物を可溶化するために必要とされる場合は、希釈水の制御に加えて、溶媒対照を使用しています。 混合容器/投与するために流量制御装置（複数可）を介して温度制御されたヘッダタンクからの希釈水を重力供給またはポ​​ンプ。ポンプは、混合容器/投薬に蠕動ポンプシステムを用いて化学株（複数可）を濃縮しました。所望の露光濃度を達成するために、水の流量（希釈水）（在庫薬品の）ポンプ速度を制御します。 注意：使用のシリコンチューブを混合容器/投薬から各試験容器に水/試験化学物質を供給すること。少なくとも24時間で75％容器の交換を提供するのに十分である流量20 Lタンク用すなわち、20ml /分を使用します。指定された公称値の±10％の流量を維持。 </li> 25±1℃、空気飽和値（5.8ミリグラムのL -1 25℃）の70％以上の溶存酸素の露光水槽の水の温度を維持し、研究を通して0.5 pH単位（6.5と8.5の間のpHを開始）を±。 16時間の光の光周期に照明条件を設定します：8時間の暗を、20分の夜明け/夕暮れの移行期間で。 魚2.5（±0.1）で新鮮に解凍凍結した大人のブラインシュリンプ（ アルテミア ）で一日二回フィードあたりのタンクあたりのグラムを養います。また、熱帯フレーク魚の餌の少量（2つの指のピンチ）で一日一回魚を食べます。各フィードの間の3時間の最小値のままにしておきます。 （対照と比較して、良好な中等度または悪い、）摂食応答/動作を監視するために毎日送り記録しておいてください。任意の食べ残しや糞を除去するために、週2回以上（好ましくは毎日）タンクを吸い上げます。少なくとも週に一度あたりの試験容器の側面と底部を清掃してください。 毎週水サンプルを取ります（分析化学を介して）（酵母画面を介して）エストロゲン活性および化学組成を確認するために、各タンクからの。採水、抽出および分析の詳細については、セクション1-3を参照してください。 注：各実験について、用量応答をモニターするために希釈水コントロール（ネガティブコントロール）、陽性対照（E2またはEE2）を加えた流出物（100、50および25％）、少なくとも3つの希釈液または試験化学物質を使用します。新技術をテストしている場合は、治療の有無にかかわらず、化合物/流出物を使用する（処理なし例えば 、EE2、TAML /過酸化水素とEE2（H 2 O 2）治療12; 図1）。 TAML /過酸化水処理を用いて、17αエチニルエストラジオールの生態毒性の除去を決定するためのin vivoでのファットヘッドミノービテロジェニンバイオアッセイの実験デザインを表す図1.図。EXPセットアップerimentalは、それぞれが水の連続流を与えた8 11 Lのガラス水槽で構成されています。個々の化学原液と水（ろ過脱塩素化）を混合チャンバに配信されます。混合容器内（反応なし）公称濃度は2 ngの/ L EE2、80 nMのTAMLおよび0.16μgの/ LH 2 O 2です。化学原液（EE2、H 2 O 2とTAML）を調製し、反応が混合容器に開始するように別々に投与します。魚（タンクあたり8男性のファットヘッドミノー）は約45分の反応接触時間後の混合物（複数可）にさらされています。水のサンプルは、毎週暴露タンクから取られています。血漿サンプルは、試験開始時に、ベースライングループからのエストロゲンのバイオマーカーのビテロジェニン（VTG）を測定するために、ファットヘッドミノーから採取した、と暴露の21日後に他のすべての魚されています。特定の治療法は以下のとおりです。 '-C';ネガティブコントロール（希釈水のみ）、 '+'。 EE2のポジティブコントロール、'+ H'; EE2プラスH 2 O 2、 '+ T'; EE2プラスH 2 O 2プラスTAML。この図は、ミルズら。2015年12から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 試験手順順応期間各性的に成熟したオスの魚の湿重量（g）を測定し、各タンク（タンクあたり8人の男性）にランダムに割り当てます。 同じバッチから未割り当ての魚をキープし、同じ試験条件の下でそれらを維持します。物理的な損傷または7日間の馴化期間中の条件の欠如の兆候を示す任意の個人を置き換えるために、これらの魚を使用してください。各処理槽が完全にテスト条件に順応している8人の男性を持つ順応期間の終了時に確認してください。 同じBAからの追加8人の男性から「ベースライン」血漿サンプルを取りますオスの魚のTCH。セクション4.4と4.5でのビテロジェニン（VTG）分析法で採血方法に従ってください。 4.2.2または4.2.3で説明したように順応期間の後、21日間露光タンクに廃液ま​​たは化学的投薬ストックを提供します。それぞれにモニタ死亡率、行動や魚の物理的な外観は、前の日の最初のフィードを毎日タンクを複製します。任意の異常行動やインシデントを記録します。 注：環境条件および供給速度は、（セクション4.2.4および4.2.5）魚の健康を維持することを確認します。 21日間の曝露期間後の魚のサンプリングサンプリングの前に12時間は、魚の供給を停止します。 血液サンプルの採取のためのラベルのマイクロ遠心チューブは、アプロチニンの〜5μlの（プロテアーゼ阻害剤）を追加し、氷の上に置きます。 脱塩素水1L当たりMS222 500mgのを溶解することにより、MS222（麻酔薬）の500 mg / Lの溶液を作製（以前順化25±1℃に）。 1 M NaOHを用いてpHを7.4±0.4にMS222を中和します。 バッファリングMS222にタンクから各魚を移動します。すべての蓋の動き（典型的には5±1分）の停止まで溶液中に保管してください。 測定と端末麻酔下フォーク長さ（mm）を記録。尻尾を切断すると、尾動脈（ 図2）から血液を収集するために、ヘパリン処理ヘマトクリット管を使用するように使い捨てメスを使用してください。慎重に前標識されたマイクロ遠心チューブに血液を分配し、氷上に保ちます。 採血直後に魚を殺します。循環および/または脳の破壊の永久停止により死亡を確認。測定し、総魚体重（最も近い0.01グラム）を記録し、必要に応じて組織を分析。 遠心分離機コレクションの2時間内の血液（4℃で5分間、7000×gで）。新しいラベルされた0.4ミリリットルのマイクロ浴槽にピペットを用いてプラズマ上清を移し氷の上でESとストア。血漿VTG濃度の分析の前に-80℃で遠心分離し、店舗の30分以内にドライアイスでプラズマを含むチューブをフリーズします。 男性のファットヘッドミノーを描いた図2.写真（Pimephalesのpromelas）、精巣の血漿採取と場所。21日間の曝露の終わりに、すべての魚は、血液サンプルを収集するために殺されるべきです。一度、この端末麻酔魚の長さ（フォーク長、ミリメートル）の下で迅速に尾動脈からの採血に続いて、測定されるべきであるフォト-A：赤い点線は尾切断（使い捨てメスの位置が尾を切断するために使用されるべきであることを示します）。 フォト-Bは、血液を収集するために使用されるヘパリン処理ヘマトクリット管を示しています。各魚は、その血液サンプルは、この場合、ヘッド全体を撮影した直後に殺されるべきボディ（ 写真-C）から切断されています。魚が殺された後、体腔内部器官を明らかにするために開放することができます。フォト-Cは、 例えば、ファットヘッドミノー、ゴキブリ、鯉など 、コイ科魚類の浮き袋（SB）に関連して精巣（生殖腺）の位置を示し、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ファットヘッドミノーのために特別に設計された相同VTGの酵素免疫測定法（ELISA）キットを用いて、血漿VTG濃度を測定します。 製造業者のプロトコルに概説されているようVTG規格およびバッファを準備します。 5,000および1：血漿サンプル1:50 1を希釈500,000、製造者の指示に従ってVTG標準曲線の範囲内で測定値を得るために、二重にしてアッセイします。ビテロゲニン濃度を計算するために、メーカーのガイドラインに従ってください。 </li> インビボでのビテロジェニンとローチにおけるインターセックス誘導（Rutilus rutilus） で使用したエストロゲン活性を軽減するために高度/小説下水処理技術の5分野のアセスメント廃水処理プラントの排水口の下流に住む野生のローチのキャプチャ注：gonochoristicとエストロゲン様内分泌かく乱作用に敏感であることが知られている使用ローチ（Rutilusのrutilus）または他の豊富な淡水または汽水魚種を、。 状況13に応じて電気漁法、ネッティング、トラップまたは他の認識漁法を使用して魚を捕まえます。サンプリングのために研究室に戻って曝気タンク内の魚を運びます。 4.4.2で説明するようにマイクロ遠心チューブを準備します。 4.4.3で説明したようにバッファリングMS222を準備します。 4.4.4で詳述されるように魚を麻酔。 ターミナル麻酔下での魚の長さと重量を測定します。 ディスポを使用して、尾動脈から血液を採取クロテンヘパリン処理シリンジ。血液サンプル採取後、直ちに各魚を殺します。慎重に前標識されたマイクロ遠心チューブに血液を分配し、氷上に保ちます。ステップ4.4.7で説明したように、プラズマを準備してELISA（4.5）によりVTGを測定します。 鉗子は、各魚から2-3魚のスケールを除去し、個別に標識した小さな紙の封筒の中に置いて使用します。後で魚の年齢の決意と成長の分析のための乾燥した状態で室温で保存封筒。 メスで開いた体腔内部器官を明らかにする。 （ 図2）のいずれかの側に位置して生殖腺に浮き袋を明らかにするために、腸を取り出します。慎重に細かい鼻ピンセットで対になった生殖腺を除去し、ガラスバイアルに配置します。固定液：1時10組織の割合でブアン固定液で生殖腺をカバーしています。 組織の大きさ（固定液は、時間あたり1ミリメートルで貫通する）に応じて6-24時間ブアンで組織を残します。固定したら、ブアン固定液のANを捨てます70％工業用変性アルコール（IMS）と交換してくださいdは。組織は、組織病理学（セクション5.3）のために処理されるまで、室温で固定した組織を保管してください。 ゴキブリにおけるin vivoビテロジェニンと陰陽誘導を使用して、エストロゲン活性の分野基づく評価実験計画と設定注：in vivoでの作業開始のかなり前にタンクやパイロットプラントを設定します。システムへの魚の任意の添加前に3-4週間を流れるタンクを開始します。パラメータを維持することができることを確認するために定期的に水の流量、水質条件（pH、温度、溶存酸素など ）を監視します。 「コントロール」の脱塩素水道水、標準処理された流出物（複数可）を受け取ることができると並行して流出物（複数可）を処理した先進パイロットプラント、でサイト上で大型タンク（ 例えば 、300-1,000 L）を構築します。タンクに空気ポンプ/エアレーターを取り付けます。少なくとも6タンクVを達成するために、水の流量を設定します一日あたりolume交換。 注：必ず戦車がよく絶縁され、過度の気温の変動を防止するために網掛けしていることを確認します。デザインタンクは、行動の変化（摂食の欠如、 など ）、病気や死亡の兆候魚の観察を可能にします。 1時間各タンクに（養魚場から）ゴキブリの袋を浮遊して露光を開始します。徐々に水の温度になるまで袋に水槽の水を追加し、条件が周囲のです。そのタンクに魚をリリース。 ペレット化した魚の餌（サイズ0.5から0.8）で毎日の大人のゴキブリをフィード。食べ残しの飼料に基づいて調整小さなペレット化（ペレットサイズ、100〜300）非エストロゲンフィード14自由摂取、で毎日少年ゴキブリを養います。毎日送り記録文書化摂食応答/行動をしてください（コントロールと比較して、中程度または悪い、良いです）。 エストロゲン活性と化学組成を確認するために、各タンクから毎週水サンプルを取ります。セ水のサンプリングと分析方法の詳細については、電子セクション1-3。 魚の生殖腺15の病理組織学慎重カッティングボード上のピンセットと場所で容器から（ステップ5.1.6および5.1.7に記載）を解剖し、固定された生殖腺を除去します。 3部（前部、中間および後方）に、各パート3〜5 mm厚の断面を切るから、各生殖腺をカットするミクロトーム刃を使用してください。慎重にラベルされたプラスチックバイオプシーカセットにすべての6つのピースを置き、 表4に記載されたタイミングを用いて組織プロセッサに配置します。 ワックス埋め込む組織やロータリーミクロトーム（3-5ミクロン）のセクション。 （45℃に設定）、加熱プレート上で標識された生体接着コーティングされたガラススライドと場所のスライドに転送のセクションでは、24時間乾燥させます。 表5に詳述されたタイミングを使用して、手動または自動染色装置を使用して、スライドを染色する。染色された組織上の封入剤のドロップ、およびlを配置AY封入剤の上にガラスカバースリップは、組織を保護します。 まず、体腔15に性別や添付ファイルのポイント数を決定するために、低倍率（10Xアイライン倍率に20X、 すなわち 2X目的、）で各スライドを調べます。各魚のための任意の異常に注意してください。 高倍率（100Xや400X）では、配偶子形成段階、異常および精巣組織中の卵母細胞の存在を評価するために、組織を調べます。 （ 表6参照）0（正常な男性組織）から7（100％卵巣組織）の範囲以下のグレーディングシステムを用いて、半陰陽の重症度6を記録します。 ステップ数 治療 目的 時間（時間） 1 70％IMS 脱水 3 2 90％IMS 脱水 2.5 3 95％IMS 脱水 1.5 4 100％IMS 脱水 1.5 5 100％IMS 脱水 1.5 6 100％IMS 脱水 1.5 7 100％IMS 脱水 1.5 8 組織学の洗浄剤決済 1.5 9 組織学の洗浄剤決済 1.5 10 組織学の洗浄剤決済 1。5 11 ワックスワックスの浸透 1.25 12 ワックスワックスの浸透 1.25 20時間のTOTAL 組織病 ​​理学のための組織を含浸ワックス表4.処理体制。組織は、自動組織プロセッサで処理されなければなりません。組織は、指定された期間のための詳細なソリューションに浸漬する必要があります。 無染色。 染色 目的 時間（分） 1 組織学のクリアエージェントワックスを溶解します 15 2 <td>を100％IMS 水和 2 3 90％IMS 水和 2 4 70％IMS 水和 2 5 水道水（RUNNING） リンス 2 6 ヘマトキシリン青いしみの細胞核 10 7 水道水（RUNNING） 過剰削除 10 8 酸性化IMS 脱塩素 20秒 9 水道水（RUNNING） リンス 20秒 10 LICO 3 塩 20秒 11 水道水（RUNNING） リンス 20秒 12 1％エオシン（水） 汚れ細胞質ピンク 20秒 13 水道水（RUNNING） 過剰削除 5 14 70％IMS 脱水 2 15 90％IMS 脱水 2 16 100％IMS 脱水 5 17 組織学のクリアエージェント IMS、結合剤を削除します 5 魚の生殖腺組織のヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）染色表5.ソリューションおよび浸漬時間。スライドのallocのために、各浴に配置する必要がありますシーケンスの時間をated。組織のH＆E染色は、魚類生殖腺に対するエストロゲン排水廃液の発達や組織への影響を判断するために必要とされます。 スコア セクション説明 0 正常な雄の精巣 1 精巣組織に散在1-5卵母細胞（通常は単独）と多焦点卵精巣 2 多焦点卵精巣は、しばしば小さなクラスター中6-20卵母細胞は精巣組織に散在します 3 多焦点卵精巣、クラスタ内の21から50卵母細胞 4 > 50と<100卵母細胞。セクションは、通常は多焦点であり、テストのモザイクの外観を持っていますicularおよび卵巣組織。 5 > 100卵母細胞、通常、多焦点だけでなく、精巣組織から分離した卵巣や精巣組織の明確に識別ゾーンを有する焦点である可能性があります。 6 >セクションの生殖腺組織の50％が卵巣であると明確に上皮細胞と貪食組織によって精巣組織から分離されています。 7 セクションの生殖腺組織の100％が卵巣です。 表6.スコアリングシステムはゴキブリで半 ​​陰陽の状態の重症度を評価すること。組織学的に生殖腺組織の準備スライドを光学顕微鏡下で検査しなければならない、20Xで、100Xおよび400X倍率は、異常および精巣組織中の卵母細胞の存在を評価します。このテーブルはJoblingから変更されています<em>のら。 2006年6。