Использование батареи химических и экотоксикологических методов для оценки эффективности процессов очистки сточных вод для удаления эстрогенной потенси

Заявление по этике: Протоколы оценки эндокринных нарушений активности химических веществ / смесей в рыбе были одобрены Brunel University Лондона защиты животных и этические нормы Орган по обзору (AWERB) и Министерство внутренних дел Великобритании под животных (научные процедуры) Закон 1986. 1. Вода для сбора проб, сохранение и извлечение Образец сбор и сохранение Перед использованием очистите бутылки с подходящей поверхностью активного моющего средства. После очистки промыть бутылки с водой, процедить и сухой. Собирают образцы в стеклянные бутылки объемом 2 л емкости, содержащей консервант, состоящую из 0,5 г бромида меди (II) нитрата и 6 мл 3,6 М раствора соляной кислоты. Образцы Хранить при температуре ниже 10 ° C. Извлечь и проанализировать, как можно скорее после сбора и сохранения. Извлечение пробы и очистки (для стероидного анализа эстрогена) 10 Твердофазная экстракция (SPE) До начала добычи, чтобы уменьшить взвешенные твердые частицы, образцы для фильтрации воды с использованием 1 мкм фильтр с размером пор бумаги. После того, как фильтруется, образцы иглы с внутренним стандартом путем добавления 100 мкл дейтерированного пики внутреннего стандарта исходного раствора , содержащего 2,4,16,16-d 4 -estrone: 2,4,16,16-d 4 -17β-эстрадиол (Е2) : и 2,4,16,16-d 4 -17α-этинилэстрадиола (EE2) (все по 40 мкг / л в метаноле) до 1000 мл стоке (или 100 мл втекающий) , что приводит к внутреннему шипа 2 нг / л для сточных вод стоков пробы и 20 нг / л для проб сточных вод впадающих. Приложить одноразовые вкладыши клапанов, стирола дивинилбензола SPE картриджи и резервуары для картриджа к SPE устройства. Включите вакуумный насос, чтобы проверить оборудование надлежащим образом запечатаны. Пипетка 5 мл этилацетата в каждом резервуаре, чтобы состояние картриджей. Включите вакуумный насос (до уровня ниже 10 дюймы ртутного столба, чтобы скорость потока менее 10 мл в минуту)и тянуть через жидкость. Не позволяйте SPE картриджи высыхают. Повторите процесс с 5 мл метанола с последующим 5 мл воды. Залить каждого резервуара картриджа с водой и соединить 1/8 "тефлоновые трубки между резервуарами-картридж и образец стекла бутылок. Включите вакууме при скорости потока менее чем 10 мл в минуту и ​​позволить весь образец проходить через картридж. колба отходов по мере необходимости пустой. Тщательно высушить SPE картриджи под вакуумом (или с помощью не используя воздух или азот) , пока содержимое картриджа меняют цвет (например, от темно – коричневого до светло – коричневого). Положить чистые сухие флаконы для сбора стекла 10 мл в стойку и место внутри коллектора экстракции. Убедитесь, что каждый вкладыш выше флакона. Пипетка 8 мл дихлорметана в каждом образце резервуара, включите вакуумный насос (скорости потока менее 10 мл в минуту) и оттягивание жидкости через во флаконы для сбора. Удалить 10 мл флаконах из коллектора SPEи использовать концентраторы, чтобы уменьшить объем до 1 мл. Передача каждого образца в ампулу автоматического пробоотборника и дополнительно концентрируют до 100 мкл с использованием азота продувка оборудования. Гель-проникающей хроматографии (ГПХ) очистки Вводят 95 мкл элюированного образца экстракта в ГПХ оборудованном ВЭЖХ с использованием условий , описанных в таблице 1. Концентрат ГПХ экстракта до 200 мкл с использованием концентратора и азота продувка аппарата , а затем составляют до 2,0 мл гексана. SPE очистки Приложить одноразовые вкладыши клапанов, аминопропил картриджи и резервуары для картриджей коллектора SPE. Положить чистые сухие флаконы для сбора стекла 10 мл в стойку и место внутри коллектора экстракции. Пипетка 2 мл гексана в каждом резервуаре, чтобы состояние картриджей. Дайте жидкости проходить через картриджи. Пипетировать образец экстракта GPC в резервуар и снова позволить жидкостипроходят через картридж. Соберите образец элюат в пробирке и удалить из коллектора. Не выбрасывайте элюата. Положите новую чистую сухую пробирку 10 мл сбора в стойку и место внутри экстракционной коллектора. Для промывки картриджа, добавляют 2 мл этилацетата в гексане (30% об / об) в резервуар и оттягивание жидкости через картридж. Повторите еще 2 мл этилацетата в гексане, отбрасывая все стирок. Поместите оригинал 10 мл флакон для сбора (этап 1.2.3.2) обратно в стойку внутри коллектора экстракции. Пипетка 2 мл этилацетата в ацетоне (50% об / об) в резервуар, включите вакуумный насос (ниже 2 дюймы ртутного столба, чтобы скорость потока менее 2 мл в минуту) и оттягивание жидкости через во флакон , Повторите процесс с еще 2 мл этилацетата. Извлеките пробирку и использовать концентраторы, чтобы уменьшить объем экстракта до 1 мл. Переноса образца в меньший стеклянный флакон и использовать азот продувка оборудование, чтобы испарить тон доставать начинающегося сухости. Добавляют 100 мкл метанола и хорошо перемешать. Перенесите экстракт автоматическим пробоотборник флакон (0,3 мл вставкой) и колпачок флакона. Анализ образцов с помощью LCMS / MS (см раздел 2). Колонка: PL гель, 50 А, 300 х 7,5 мм, 5 мкм Guard Колонка: PL гель, 50 х 7,5 мм, 5 мкм Мобильная фаза: дихлорметан Скорость потока: 1 мл в минуту Температура колонки: 25 ° C УФ – детектор: 210 нм Объем впрыска: 95 мкл Режим впрыска: стендARD Ничья скорость: 500 мл в минуту Выброс скорость: 500 мл в минуту Draw позиций: 3 мм Фракция собрали: 3 мл фракции (7 – 10 мин) в 10 мл флаконах Таблица 1. Условия и параметры для гель – проникающей хроматографии (ГПХ) очистки извлеченных проб сточных вод. Таблица детали колонки ГПХ, подвижной фазы, температуру, объем впрыска и длины волны детектора. экстракции образца (для дрожжей Эстроген экран) Образцы фильтров, как описано в разделе 1.2.1.1. Приложить одноразовые вкладыши клапанов, С18 SPE картриджи и резервуары для картриджа к SPE устройства. Включите вакуумный насос, чтобы проверить оборудование надлежащим образом герметизированы. Пипетка 5 мл метанола в каждый резервуар, кондиционировать C18 картриджей. Включите вакууме (около 5 INhg, чтобы позволить потоку приблизительно 5 мл в минуту) и дайте жидкости пробегают, делая паузу в течение 1 мин на полпути через. Не позволяйте картриджи всухую. Повторите процесс либо с помощью ВЭЖХ или дважды дистиллированной водой (DDH 2 O). Опять же не иссякнет. Извлечение пробы воды, как описано в разделе 1.2.1.4. Продолжить вакуум в течение не менее 30 минут, чтобы полностью высохнуть картриджи. Поместите чистую сухую флаконы для сбора 10 мл в стойку в коллекторе экстракции. Убедитесь, что каждый вкладыш выше флакона. Добавить 5 мл метанола в каждом резервуаре. Включите вакуумный (максимальный поток 5 мл / мин) и позволяет жидкости проходить через картридж в пузырек, делая паузу в течение 2 мин на полпути через. Перед проведением анализа с использованием экрана Да, уменьшить экстракт начинающегося сухости с использованием азота и воссоздавать с 500-1000 мкл этанола. Печать крышках образцов флаконов, чтобы избежать испарения и хранить при температуре 4 ° С (в неискрящиехолодильник). 2. Анализ химических веществ Использование LCMS / MS Оптимизация условий эксплуатации системы ЖХ / MS, используя инструкции производителя. Анализ калибровочных стандартных растворов, экстрактов образцов, пустой и аналитического контроля качества (AQC) образцов с помощью жидкостной хроматографии и масс условия спектрометрии, а также контролировать ионные переходы , как указано в таблице 2. Определить концентрацию стероидных эстрогенов в экстракте образца с использованием внутренних стандарты 10. ЖХ жидкостной хроматографии Колонка: С18 (2), 150 х 4,6 мм, 5 мкм. Объем впрыска: 20 мкл Поток: 0,5 мл в минуту. MOBILE фаза: Растворитель А: вода, содержащая 0,1% аммиака. Растворитель В: ацетонитрил. Градиент программа: Время (мин) 0 10 18 24 28 A: соотношение B растворителя 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00 Масс-спектрометрии Источник: Электрораспылительная (отрицательный ион) Газ и источник: CUR: 20 фунтов на квадратный дюйм, GS1: 70 фунтов на квадратный дюйм, GS2: 30 фунтов на квадратный дюйм ТЭМ: 600 ° C, CAD газа 5 и IonSpray напряжение -900 MRM переходов: </td> Е1: 269/145 и 269/143 Е2: 271/145 и 271/143 ЕЕ2: 295/145 и 295/143 E1-D4: 273/147 E2-D4: 275/147 ЕЕ2-D4: 299/145 Таблица 2. Детали параметры и условия для ЖХ / МС анализа стероидных эстрогенов в экстрактах сточных вод. Таблица дает образец объемом впрыска и расхода, условия подвижной фазы вй градиент. 3. эстрогенной активности Использование In Vitro Дрожжи Эстроген экран (ДА) Анализ 8 Подготовить и хранить минимальные средние и средние компоненты в соответствии с таблицей 3 (а) (г). (а) Минимальное Среднее (рН 7,1): Приготовьте Fe 2 (SO 4) 3 раствора добавлением 40 мг Fe 2 (SO 4) 3 до 50 мл дважды дистиллированной водой (DDH 2 O) Добавить 1 л DDH 2 O в стеклянный стакан , 2 л Добавьте следующие компоненты в стакан: 13,61 г KH 2 PO 4 1,98 г (NH 4) 2 SO 4 4,2 г KOH 0,2 г MgSO 4 1 мл Fe 2 (SO 4) <suб> 3 раствор 50 мг L-лейцин 50 мг L-гистидин 50 мг аденин 20 мг L-аргинин-HCl 20 мг L-метионин 30 мг L-тирозин 30 мг L-изолейцин 30 мг L-лизин-HCl, 25 мг L-фенилаланина 100 мг L-глутаминовой кислоты, 150 мг L-валин 375 мг L-серин Поместите стакан на нагретую мешалкой с магнитным блохи и перемешивать до тех пор, пока не будет все растворили Убедитесь, что значение рН 7,1 и при необходимости отрегулировать Использование 50 мл стерильный шприц обойтись 45 мл аликвоты в стеклянные бутылки с металлическими винтами, верхняя крышка Стерилизация минимальной среде при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве Хранить при комнатной температуре (б) D – (+) – глюкоза: Приготовьте 20% вес / об раствора в DDH 2 O Разлить по 20 мл аликвоты в стеклянных флаконах с металлическими винтовыми крышками верхних Стерилизацию раствора глюкозы при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве Хранить при комнатной температуре (в) L-аспарагиновой кислоты: Сделайте раствор с концентрацией 4 мг / мл в DDH 2 O Разлить по 20 мл аликвоты в стеклянных флаконах с металлическими винтовыми крышками верхних Стерилизуют раствор L-аспарагиновой кислоты при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве Хранить при комнатной температуре (d) Витамин Решение: Готовят раствор биотин добавлением 2 мг биотина к 100 мл DDH 2 O Взвесить 8 мг тиамина, 8 мг пиридоксина, 8 мг пантотеновой кислоты, 40 мг инозитол. Добавить все сухие компоненты и 20 мл раствора биотина до 180 мл DDH 2 O Сделайте 10 мл аликвоты стерильной фильтрацией через 0,2 мкм с размером пор одноразовый фильтр в стерильные стеклянные бутылки с, в шкафу с ламинарным потоком воздуха Хранить при температуре 4 ° С (е) L-Треонин: Приготовьте 100 мл 24 мг / мл L-треонина в DDH 2 O Разлить 10 мл аликвоты в стеклянных флаконах с металлическими винтовыми крышками верхних Стерилизацию раствора L-треонина при 121 ° С в течение 10 мин в автоклаве Хранить при комнатной температуре <stРонг> (е) меди (II) Сульфат: Подготовьте 25 мл (II) сульфат раствор 20 мМ меди в DDH 2 O Приготовьте 5 мл стерильной аликвоты с помощью фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм в стерильные стеклянные флаконы, в шкафу с ламинарным потоком Хранить при комнатной температуре (г) Хлорфенол красно-β-D-галактопиранозида (CPRG): Приготовьте 25 мл 10 мг / мл раствора CPRG в DDH 2 O Приготовьте 5 мл стерильной аликвоты с помощью фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм в стерильные стеклянные флаконы, в шкафу с ламинарным потоком Хранить при температуре 4 ° С Таблица 3. Дрожжи анализ Эстроген экрана; подготовка и хранение минимальных средних и средних компонентов. Подготовка и StoraGE 10х концентрированной культуры дрожжей На 1-й день, подготовить среду для роста (как описано в пункте 3.4.1) и вылить в стерильную коническую колбу. Добавить 125 мкл 10-кратного концентрированного дрожжей из криогенной флаконе хранили при -20 ° C. Выдержите привит носитель при температуре 28 ° С в течение приблизительно 24 ч на орбитальном шейкере. На 2-й день, сделайте две бутылки среды роста (~ 50 мл) и вылить в отдельные стерильные конические колбы. Добавьте 1 мл 24-часового культивированных дрожжей в каждую колбу питательной среды. Выдержите привит носитель при температуре 28 ° С в течение приблизительно 24 ч на орбитальном шейкере. На 3-й день, влить каждый 24-часовой культуры в стерильную 50-мл центрифужную пробирку. Центрифугируйте 50 мл пробирки при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 2000 х г. Слейте надосадочную и повторно приостанавливать каждый осадок в 5 мл минимальной среды с 15% глицерина. Сделать 0,5 мл аликвот 10х концентрированной культуры дрожжей в 1,2 мл стерильной криопробирки и хранить при температуре -20 ° С в течение не более 4-х месяцев. Подготовительномрацион и хранение химических запасов для стандартных кривых Промыть все изделия из стекла и шпатели дважды с абсолютным этанолом и оставить высохнуть перед использованием, чтобы удалить любые следы загрязняет. Взвесить Е2 непосредственно в стеклянный флакон в шкафу для взвешивания порошка и регулировать концентрацию по объему в абсолютном этаноле. Разбавляют до концентрации 2х10 -7 М (54,48 мкг / л). Уплотнение крышки и хранят при температуре 4 ° С (в безыскровый холодильнике). Анализ производителя В день 0 готовят среду для роста. К 45 мл бутылки минимальной среде добавляют 5 мл раствора глюкозы, раствор 1,25 мл L-аспарагиновой кислоты, 0,5 мл раствор витаминов, 0,4 мл раствора L-треонин, и 125 мкл меди (II), раствор сульфата. Налейте ростовую среду в стерильную коническую колбу. Добавить 125 мкл 10-кратного концентрированного запаса (размороженной от хранения -20 ° C) в колбу и инкубировать инокулированных носитель при температуре 28 ° С в течение приблизительно 24 ч на орбитальном шейкере. На 1 -й день, маркировать стерильный 96-луночный 'разбавление пластину и сделать серийных разведений (100 мкл объемы в этаноле) Е2 стандартной кривой и исследуемого вещества (S) / отходящем экстракта (ов) (например, ЕЕ2). Этикетка стерильный 96-луночный оптически плоское дно Микротитровальный 'планшету (s)'. На каждой пластине включают пробелы (плюс / минус растворителя) и стандартную кривую Е2, в дополнение к строкам исследуемого вещества (ов) / вытекающего экстракта (ов). Пипетка 10 мкл каждой концентрации (Е2, химические или экстракт) в соответствующую лунку планшета для анализа. Внесите 10 мкл этанола в каждую "растворителя" пустой лунки планшета для анализа. Оставьте планшет для анализа с крышкой прочь, чтобы выпарить досуха. Сделать бутылку ростовой среды (~ 50 мл) и добавляют 0,5 мл раствора хлорфеноле красно-β-D-галактопиранозида (CPRG) за бутылку. Определить плотность дрожжевых клеток в 24-часовой культуры путем измерения мутности культуры при 620 нм в планшет-ридере. Прививать Assay среда с 4×10 7 клеток дрожжей из 24 ч культуры. Налейте прививку среды для анализа в стерильный корыто. Используя пипетку многоканальную по 200 мкл засеянных среды для анализа в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа. Положите крышку на планшете для анализа 96-луночного и запечатать края с лентой. Встряхнуть планшет для анализа (ы) энергично в течение 2 мин на титр шейкере и инкубировать при 32 ° С в естественной вентиляцией сушильном шкафу. На 2-й день, встряхните планшет для анализа (ы) энергично на титр шейкере в течение 2 мин. Возврат к 32 ° С инкубатор. На 4-й день, встряхните планшет для анализа (ы) энергично в течение 2 мин на титр шейкере. Оставьте пластину (ы), чтобы стоять в течение приблизительно 1 часа, а затем прочитать аналитический планшет (ы) при поглощении 540 нм (оптимальное оптической плотности CPRG ~ 575 нм) и 620 нм (для мутности) с использованием планшет-ридера. Оставьте пластину (ы) при комнатной температуре и читать позже, если это необходимо. Расчеты эстрогенной активности <ол> Правильные показания анализа на мутность, используя следующее уравнение: устранен значение = образец или стандарт (Е2) оптическую плотность при длине волны 540 нм – [образец или стандарт (Е2) оптическую плотность при длине волны 620 нм – оптическая плотность заготовки при 620 нм]. Участок E2 стандартной кривой с соответствующими пробелами (для проверки на предмет загрязнения) 8. Используйте исправленный образец (экстракт или химический) для расчета 'эстрадиола эквивалентов. Используйте проложенным значения стандартной кривой E2 и уравнение регрессии (3-параметр полиномиальное или линейный в зависимости от размера), чтобы интерполировать образец / извлечения значений оптической плотности для эквивалентных значений Е2. Использование коэффициента концентрации (то есть, извлеченной воды и объем этанола экстракт ресуспендировали в) для расчета эстрогенной активности в предварительно извлеченный образце. 4. Оценка лаборатории на базе эстрогенных Использование В Vivo вителлогенина индукции в Мале толстоголовому пескарей Используйте мужские толстоголового гольяна (Pimephalesпенью)> 4 месяца, которые показывают вторичные половые признаки (например, развитие брачных бугорков и спинные fatpad) свидетельствует о мужской сексуальной определения. Для предотвращения нерест активности, отдельные пожилые мужчины три недели (± 3 дня) до начала испытания. Установка по меньшей мере, два 45 л стеклянный аквариумы с максимальной загрузкой 3 г / л. Для обеспечения достаточного количества здоровых рыб для теста, использовать минимум 100 мужчин. Хранить Самец в одинаковых условиях окружающей среды , как будет иметь опыт в тесте (то есть, температура воды 25 ± 1 ° С и 16 а: 8 ч свет: темнота фотопериод). Поддержание скорости потока воды для разбавления в каждой емкости , чтобы обеспечить 95% времени замены , по меньшей мере , каждые 6 до 8 ч, т.е. 330 мл / мин в течение 45 л бак. Испытательное оборудование и опытно-конструкторских Используйте большие стеклянные резервуары для размещения загрузки до 3 г рыбы на литр очистэ. Для 8 взрослых самцов (номинально 4,5 г каждая), используют 10-20 л бак. Используйте две дублирующие емкости для каждой обработки и оградить каждый танк от любых ненужных визуальных помех (например, используйте слоистые экраны карты между танками). Определите каждый танк с номером исследования, концентрации экспозиции и идентификационный номер судна. Для исследования сточных вод сточных вод По прибытию, немедленно передать сточные воды в резервуар для хранения при 10 ± 1 ° С. Начало дозирования стоков в течение двух часов с момента получения выходящего потока. Поток выходящего потока, с помощью перистальтического насоса, от 10 & deg; С резервуара к акклиматизации судна. Нагреть сточные воды в акклиматизации сосуде до 18 ± 2 ° С. Насос нагретого выходящего потока из акклиматизации сосуда до дозирование / емкости для смешивания, а затем к испытательному аквариумах (который держит рыбу). Тепло аквариумы до температуры 25 ± 1 ° С. Для химических исследований дозирования Взвесьте испытаний химических веществ в шкафу порошка весом. Приготовьте концентрированные химические запасы в DDH 2 O предпочтительно без использования растворителей. Примечание: Если растворители требуются для солюбилизации тестируемых соединений, используют средства управления растворитель, в дополнение к контролю разбавления водой. бачком или разбавление водяной насос из контролируемой температурой бачком через устройство (а) управления потоком дозирования / емкость для смешивания. Насос концентрированные химические запаса (ов) с использованием перистальтического насосной системы для дозирования / смешивания сосудов. Управление скорость насоса (на складе химических) и скорости потока воды (разбавление водой) для достижения желаемой концентрации воздействия. Примечание: Используйте силиконовые трубки, чтобы питательная вода / химически испытание для каждого испытательного сосуда из дозирования / емкость для смешивания. Используйте скорость потока, достаточную для обеспечения замены сосуда на 75% , по меньшей мере 24 ч, т.е. 20 мл / мин в течение 20 л бак. Поддержание скорости потока на ± 10% от указанного номинального значения. </li> Поддержание температуры экспозиции бака для воды при 25 ± 1 ° C, растворенного кислорода выше 70% от стоимости насыщения воздуха (5,8 мг L -1 при 25 ° C) и ± 0,5 единицы рН (начиная рН от 6,5 до 8,5) на протяжении исследования. Установить условия освещения на фотопериод 16 ч света: 8 ч темноты, с рассвета / сумерек переходных периодов 20 мин. Поток рыбы два раза в день со свежей размороженной замороженное взрослых артемии (Artemia) 2,5 (± 0,1) г на танке на корм. Также кормить рыб один раз в день с небольшим количеством (два пальца щепоткой) тропических рыб чешуйчатый пищи. Оставьте как минимум 3 часа между каждым кормлением. Держите ежедневные записи для кормления, чтобы следить за реакцией кормления / поведение (хорошее, умеренное или плохое, по сравнению с контрольной группой). Сифон танки по крайней мере два раза в неделю (желательно ежедневно), чтобы удалить остатки корма и экскременты. Очистите стороны и днища испытательных судов не реже одного раза в неделю. Возьмите пробу воды еженедельноs из каждого резервуара для подтверждения эстрогенной активности (через экран дрожжами) и химический состав (с помощью аналитической химии). См разделы 1-3 для деталей взятия проб воды, извлечения и анализа. Примечание: Для каждого эксперимента используют контроль разбавляющей воды (отрицательный контроль), положительный контроль (E2 или EE2) плюс по меньшей мере три разведений вытекающего потока (100, 50 и 25%) или химически испытание для мониторинга реакции от дозы. Если испытываются новые технологии, используют соединение / сточные воды с лечением или без него (например, eE2 без лечения, ЕЕ2 с TAML / перекиси водорода (H 2 O 2) лечение 12; Рисунок 1). Рисунок 1. Диаграмма , представляющая экспериментальную конструкцию в естественных условиях Гольян вителлогенина биопробы , чтобы определить удаление экотоксичности 17 & этинилэстрадиола с использованием обработки воды TAML / пероксида. Ехрerimental создана состоит из восьми 11 л стеклянных аквариумах каждый кормили с непрерывным потоком воды. Индивидуальные химические растворы и стоковые воды (фильтрованное де-хлорированной) доставляются в смесительные камеры. Номинальные концентрации (без реакции) в смесительных сосудах являются 2 нг / л ЕЕ2, 80 нМ TAML и 0,16 мкг / LH 2 O 2. Химические исходные растворы (ЕЕ2, H 2 O 2 и TAML) получают и дозируют отдельно , так что реакции начинаются в смесительных сосудах. Рыба (8 самцов толстоголовые пескарей в танк) подвергаются смеси (ами) По истечении времени реакции контакта примерно 45 минут. Пробы воды берутся из резервуаров экспозиции еженедельно. Образцы плазмы взяты из толстоголового пескарями для измерения эстрогенной биомаркеров вителлогенина (VTG) от базовой линии группы, в начале исследования, а также все другие рыбы после 21 дней воздействия. Конкретные процедуры: '-C'; Отрицательный контроль (разведение только вода), '+'; положительный контроль eE2,'+ Н'; ЕЕ2 плюс H 2 O 2, '+ T'; ЕЕ2 плюс H 2 O 2 плюс TAML. Эта цифра была изменена от Миллса и др. 2015 12. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Тестовая процедура периода акклиматизации Мера мокрый вес (г) каждого половозрелого самца рыбы, а также выделить в случайном порядке для каждого танка (8 мужчин в бак). Хранить незанятого рыбу из той же партии, и поддерживать их в тех же самых условиях испытаний. Используйте эти рыбы для замены любых лиц, которые показывают признаки физического повреждения или отсутствия состояния в период акклиматизации 7 дней. Обеспечить в конце периода акклиматизации каждый танк лечение 8 мужчин, которые полностью акклиматизировались к условиям испытаний. Возьмем «базовые» образцы плазмы из дополнительных 8 самцов из того же баTCH мужской рыбы. Следуйте метод отбора проб крови в разделе 4.4 и метод вителлогенина (VTG) анализа в 4.5. После периода акклиматизации, доставки сточных вод или химических запасов дозирования к танкам воздействия в течение 21 дней, как описано в разделе 4.2.2 или 4.2.3. Монитор смертности, поведение и внешний вид рыбы в каждом реплицировать бак ежедневно до начала первой подачи дня. Запись любого ненормального поведения или инцидентов. Примечание: Убедитесь, что условия окружающей среды и кормления темпы поддержания здоровья рыбы (разделы 4.2.4 и 4.2.5). Рыба Пробы после 21-дневного периода воздействия 12 ч до отбора проб, прекратить кормление рыб. Этикетка микро-центрифужные пробирки для сбора образцов крови, добавляют ~ 5 мкл апротинина (ингибитор протеазы) и поместить их на лед. Сделать 500 мг / л раствора MS222 (обезболивающий) путем растворения 500 мг MS222 на 1 л де-хлорированной воды (ранее акклиматизировалисьдо 25 ± 1 ° С). Нейтрализовать MS222 до рН 7,4 ± 0,4 с использованием 1 М NaOH. Переместить каждую рыбу из резервуара в буферном MS222. Хранить в растворе до прекращения всякого движения крышечкой (как правило, 5 ± 1 мин). Измерьте и запишите длину вилки (мм) под клеммной анестетика. Используйте одноразовый скальпель , чтобы ампутировать хвост, и использовать гепарином hemocrit трубку , чтобы собрать кровь из хвостовой артерии (рис 2). Тщательно дозировать кровь в предварительно меченных трубки микроцентрифужных и держать на льду. Убейте рыбу сразу же после нанесения крови. Подтверждение смерти путем постоянного прекращения циркуляции и / или разрушению мозга. Измерьте и запишите общий вес рыбы (до ближайшего 0,01 г) и рассекают ткани по мере необходимости. Центрифуга крови (7000 мкг в течение 5 мин при 4 & deg; С) в течение 2 часов сбора. Передача супернатант плазмы с помощью пипетки в новую меченым 0,4 мл микроцентрифужных ванныэс и хранить на льду. Замораживание пробирки, содержащие плазму на сухом льду в течение 30 мин центрифугирования и хранят при -80 ° С перед анализом концентрации в плазме VTG. Рисунок 2. Фотографии , изображающие мужчин Гольян (Pimephales пенью), сбор плазмы и расположение семенников. В конце экспозиции 21-дневного все рыбы должны быть убиты , чтобы собрать образцы крови. После того, как в рамках этого терминала анестетика длины рыбы (длина вил, мм) должна быть измерена, быстро , с последующим сбором крови из хвостовой артерии Photo-A:. ​​Красная пунктирная линия указывает на расположение хвоста ампутации (одноразовый скальпель следует использовать ампутировать хвост ). Фото-B показывает гепарином hemocrit трубки , используемой для сбора крови. Каждая рыба должна быть затем убит сразу после того, как его образец крови был взят, в этом случае вся головабыла отделена от тела (Фото-C). После того, как рыба была убита полость тела может быть открыта, чтобы выявить внутренние органы. Фото-C показано расположение семенников (гонад) по отношению к плавательного пузыря (SB) в карповых рыб, например, толстоголовому гольян, плотва, сазан и т.д. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Измерение концентрации в плазме VTG с гомологичной иммуноферментного анализа (ИФА) комплект VTG, разработанный специально для толстоголового пескарей. Подготовить стандарты и буферы VTG, как указано в протоколе изготовителя. Разреженной плазмы образец 1:50, 1: 5000 и 1: 500000 и пробирного их в двух экземплярах для получения показаний в пределах диапазона стандартной кривой VTG в соответствии с инструкциями изготовителя. Следуйте рекомендациям изготовителя для расчета концентрации вителлогенина. </li> 5. Полевые оценки перспективных / Novel водоочистных технологий для Смягчение эстрогенной активности Использование В Vivo вителлогенина и интерсексуальной индукции в Роач (КиШиз гиШиз) Захват диких плотвы, живущих вниз по течению от водоотводах очистных сооружений сточных вод Примечание: Используйте плотва (КиШиз гиШиз) или другие обильные пресноводные или солоноватой видов рыб, которые являются gonochoristic и , как известно, чувствительны к эстрогенным эндокринных нарушений. Ловить рыбу с помощью электрорыболовства, плетение, захват или другие признанные методы промысла в зависимости от ситуации 13. Транспортировка рыбы в вентилируемых резервуарах обратно в лабораторию для отбора проб. Подготовьте микроцентрифужных трубки, как описано в разделе 4.4.2. Приготовьте буферном MS222, как описано в разделе 4.4.3. Обезболить рыбы, как описано в 4.4.4. Измерьте длину рыбы и вес под наркозом терминала. Собрать кровь из хвостовой артерии с использованием DISPOсоболь гепарином шприц. Убейте каждую рыбу сразу же после взятия пробы крови. Тщательно дозировать кровь в предварительно помеченных микропробирок и держать на льду. Подготовьте плазму, как описано в шаге 4.4.7 и измеряют VTG с помощью ELISA (4.5). С помощью щипцов удалить 2-3 рыбью чешую из каждой рыбы и место в индивидуальном порядке меченные небольшие бумажные конверты. Храните конверты при комнатной температуре в сухих условиях для определения возраста рыб позже и анализа роста. Открытая полость тела с помощью скальпеля, чтобы выявить внутренние органы. Вынимают кишку , чтобы выявить плавательного пузыря с гонад , расположенной по обе стороны (рисунок 2). Осторожно удалите парные гонады с мелкими носатый щипцов и поместите в стеклянную пробирку. Накройте гонады с фиксатором Буэна в соотношении 1:10 ткани: фиксаж. Оставьте ткань в Буэна в течение 6-24 ч в зависимости от размера ткани (Фиксирующий проникает через 1 мм в час). После того, как фиксированной, слейте фиксаторный А.Н. Буэнаd заменить 70% промышленных денатурата (IMS). Храните фиксированной ткани при комнатной температуре до тех пор, пока ткани обрабатываются для гистопатологии (раздел 5.3). Поле на основе оценки эстрогенной активности с использованием в естественных условиях вителлогенина и интерсексуальной индукции в плотвы Экспериментальный дизайн и настройка Примечание: Установить танки и опытно – промышленной установки и до начала работы естественных условиях , начиная с. Начните танки, протекающие за 3-4 недели до какого-либо добавления рыбы к системе. Мониторинг расхода воды, качества и условий (рН, температура, содержание растворенного кислорода и т.д.) регулярно , чтобы убедиться параметры воды могут быть сохранены. Построить большие резервуары (например, 300-1000 л) на месте на опытном заводе, который может получить контроль над '' де-хлорированной водопроводной воды, очищенных сточных вод стандарт (ы) и расширенный очищенные сточные воды (ы) параллельно. Присоединить воздушный насос / аэраторов к танкам. Установить расход воды для достижения по меньшей мере, 6 танк Volume обмены в день. Примечание: Убедитесь, что танки хорошо изолированы и затененных, чтобы предотвратить чрезмерное ежедневные колебания температуры. Проектирование резервуаров , чтобы наблюдение за рыбами, для поведенческих изменений (отсутствие кормления и т.д.), признаков заболевания и смертности. Начало экспозиции плавучими мешки плотва (от рыбного хозяйства) в соответствующих резервуарах в течение 1 часа. Добавьте резервуар для воды до мешков постепенно, пока температура воды и условий окружающей среды. Отпустите рыбу в их танки. Корма для взрослых плотва ежедневно на гранулированных корм для рыб (размер 0,5-0,8). Поток несовершеннолетних плотва ежедневно на небольшом осаждали (размеры гранул 100-300) без эстрогенной подачи 14 вволю, скорректированной на основе непотребленного корма. Держите ежедневные записи подачи ответа документальное кормление / поведение (хорошо, умеренный или плохой, по сравнению с контрольной группой). Возьмем еженедельно образцы воды из каждого резервуара для подтверждения эстрогенной активности и химический состав. Seе секции 1-3 для подробностей отбора и анализа проб воды методами. Гистологическое рыбы гонады 15 Осторожно снимите расчлененный и фиксированные гонады (описанные в пунктах 5.1.6 и 5.1.7) из контейнера с помощью пинцета и положите на разделочную доску. Используйте микротома лезвие, чтобы разрезать каждую гонады на 3 части (передняя, ​​середины и задней) и от каждой части вырезать толстый поперечное сечение 3-5 мм. Осторожно поместите все шесть штук в маркированные кассету пластиковой биопсии, и поместить в процессор ткани с использованием тайминги , перечисленных в таблице 4. Восковые встраивать ткани и участок на ротационный микротом (3-5 мкм). Перенос разделов с меченым био-клей для стекла с покрытием слайдов и место слайдов на нагретую пластину (установленной на уровне 45 ° С), чтобы высохнуть в течение 24 часов. Пятно слайды, либо вручную , либо с помощью автоматизированной Стайнер, используя тайминги , подробно описанные в таблице 5. Поместите каплю монтажного агента на окрашенном ткани, а лау покровным стеклом над монтажными средство для защиты ткани. Во- первых, рассмотрим каждый слайд при низком увеличении (20х, то есть цель 2X, с 10 – кратным увеличением глаз линиями) , чтобы определить пол и количество точек вложений в полости тела 15. Обратите внимание на любые отклонения для каждой рыбы. При большем увеличении (100X или 400X), исследовать ткани для оценки стадии гаметогенеза, аномалии и наличие ооцитов в тестикулярной ткани. Запишите тяжесть интерсекса с использованием следующей системы классификации в диапазоне от 0 (нормальный мужской ткани) до 7 (100% ткани яичников) 6 (смотри таблицу 6). Шаг номер лечение Цель Время (ч) 1 70% IMS дегидратация 3 2 90% IMS дегидратация 2.5 3 95% IMS дегидратация 1.5 4 100% IMS дегидратация 1.5 5 100% IMS дегидратация 1.5 6 100% IMS дегидратация 1.5 7 100% IMS дегидратация 1.5 8 Гистологии осветлитель клиринг 1.5 9 Гистологии осветлитель клиринг 1.5 10 Гистологии осветлитель клиринг 1.5 11 ВОСК Воск инфильтрации 1,25 12 ВОСК Воск инфильтрации 1,25 20 ч ИТОГО Таблица 4. Режим обработки для воска для пропитки тканей для гистопатологии. Ткани должны быть обработаны в автоматическом процессоре ткани. Тканей должен быть погружен в растворах подробно в течение периода времени, указанного. Пятно нет. пятно Цель Время (мин) 1 Гистологии осветлитель Растворяет воск 15 2 <td> 100% IMS гидратация 2 3 90% IMS гидратация 2 4 70% IMS гидратация 2 5 Водопроводная вода (RUNNING) Полоскание 2 6 HAEMOTOXYLIN Пятна ядер клеток синий 10 7 Водопроводная вода (RUNNING) Удалить избыток 10 8 подкисленных IMS Дехлорирование 20 сек 9 Водопроводная вода (RUNNING) Полоскание 20 сек 10 LiCO 3 Поваренная соль 20 сек 11 Водопроводная вода (RUNNING) Полоскание 20 сек 12 1% эозином (ВОДНЫЙ) Пятна цитоплазма розовый 20 сек 13 Водопроводная вода (RUNNING) Удалить избыток 5 14 70% IMS дегидратация 2 15 90% IMS дегидратация 2 16 100% IMS дегидратация 5 17 Гистологии осветлитель Удалить IMS, связывающий агент 5 Таблица 5. Решения и время погружения для гематоксилином и эозином (H & E) окрашиванием рыбы гонадной тканей. Слайды должны быть помещены в каждую ванну для Allocованные время в определенной последовательности. H & E окрашивание тканей требуется для определения развития или организационных последствий эстрогенного сточных водах на рыбных гонад. Гол Раздел Описание 0 Нормальный мужской семенник 1 Мультифокальная ovotestis с 1-5 ооцитов (обычно однократно), рассеянных среди тестикулярной ткани 2 Мультифокальная ovotestis, 6-20 ооцитов часто в небольших кластеров разбросаны среди тестикулярной ткани 3 Мультифокальная ovotestis, 21-50 ооцитов в кластерах 4 > 50 и <100 ооцитов. Раздел обычно мультифокальной и имеет вид мозаики из тестаicular и овариальной ткани. 5 > 100 ооциты, как правило, мультифокальной, но также может быть очаговым с четко идентифицируемых зон яичников и тестикулярной ткани, отделенного от ткани яичка. 6 > 50 процентов гонадальной ткани на участке находится в яичнике и четко отделены от тестикулярной ткани эпителиальными клетками и фагоцитирующих тканей. 7 100 процентов гонадной ткани на участке является овариальный. Таблица 6. Система скоринга для оценки тяжести состояния интерсексуальной в плотвы. Гистологически подготовленные слайды гонадной ткани должны быть исследованы под световым микроскопом, на 20X, 100X и 400X увеличение, для оценки каких – либо отклонений и наличие ооцитов в тестикулярной ткани. Эта таблица изменяется от Джоблинга <EM> и др. 2006 6.