Utilisation d'une batterie de produits chimiques et écotoxicologiques Méthodes pour l'évaluation de l'efficacité des processus de traitement des eaux usées pour supprimer œstrogénique Potency

déclaration éthique: Protocoles d'évaluation perturbateurs endocriniens activité de produits chimiques / mélanges dans les poissons ont été approuvés par la protection des animaux de Brunel University de Londres et du corps éthique critique (AWERB) et par le Home Office du Royaume-Uni sous les Animaux (Scientific Procedures) Act 1986. Prélèvement des échantillons 1. L'eau, la préservation et Extraction collecte et préservation échantillon Avant utilisation, nettoyer les bouteilles avec une surface appropriée agent de nettoyage actif. Après le nettoyage, rincer les bouteilles avec de l'eau, les égoutter et sécher. Prélever des échantillons dans des flacons en verre d'une capacité de 2 litres contenant un conservateur constitué de 0,5 g de cuivre (II), le nitrate et 6 ml d'une solution 3,6 M d'acide chlorhydrique. Conserver les échantillons en dessous de 10 ° C. Extraire et analyser le plus tôt possible la collecte et la conservation suivante. Extraction de l' échantillon et de nettoyage (pour l' analyse de l' oestrogène stéroïde) 10 Extraction en phase solide (SPE) Avant extraction, afin de réduire les matières en suspension, des échantillons d'eau de filtre à l'aide de 1 um papier pores de filtre de taille. Une fois filtrée, des échantillons de pointes avec étalon interne en ajoutant 100 pi de dopage solution étalon interne deutéré mère contenant 2,4,16,16-d 4 -estrone: 2,4,16,16-d 4 -17β-estradiol (E2) et 2,4,16,16-d4 -17α-éthinylestradiol (EE2) (tous à 40 g / L dans du methanol) à 1000 ml d' effluent (ou 100 ml affluente) conduisant à pic interne de 2 ng / l pour les eaux usées les échantillons d'effluents, et 20 ng / L pour les échantillons de boues d'influent. Fixer sacs jetables de soupapes, des cartouches de SPE styrène divinyl benzène et les réservoirs de la cartouche dans l'appareil de SPE. Mettre la pompe à vide pour tester l'équipement est convenablement scellé. Introduire à la pipette 5 ml d'acétate d'éthyle dans chaque réservoir, pour le conditionnement des cartouches. Mettre en marche la pompe à vide (au-dessous de 10 poHg pour permettre à un débit inférieur à 10 ml par minute)et tirez à travers le liquide. Ne laissez pas les cartouches de SPE dessèchent. Répéter l'opération avec 5 ml de méthanol suivi par 5 ml d'eau. Recharger chaque réservoir de la cartouche avec de l'eau et raccorder 1/8 "tubes PTFE entre les réservoirs de la cartouche et les flacons d'échantillons en verre. Mettre le vide à une vitesse inférieure à 10 ml par minute de débit et permettre à l'ensemble de l'échantillon de passer à travers la cartouche. Videz le flacon de déchets si nécessaire. Sécher soigneusement les cartouches SPE sous vide (ou en utilisant de l' air ou de l' azote) jusqu'à ce que le contenu de la cartouche changer de couleur (par exemple, du brun foncé au brun clair). Mettre 10 ml des flacons de collecte de verre sèches et propres dans le rack et place à l'intérieur du collecteur d'extraction. Vérifiez que chaque chemise est au-dessus d'un flacon. Pipette 8 ml de dichlorométhane dans chaque réservoir d'échantillon, interrupteur sur la pompe à vide (taux inférieur à 10 ml par minute) et tirer le liquide à travers dans les flacons de collecte. Retirer flacons de 10 ml à partir du collecteur SPEet utiliser un concentrateur pour réduire le volume à 1 ml. Transférer chaque échantillon dans l'auto-échantillonneur flacon et se concentrer davantage à 100 pi avec de l'azote chablis équipement. Chromatographie sur gel perméable (GPC) nettoyage Injecter 95 ul de l'extrait d'échantillon élué dans le HPLC équipé GPC en utilisant les conditions décrites dans le tableau 1. Concentré GPC extrait jusqu'à 200 ul en utilisant un concentrateur et d' azote soufflent vers le bas appareil et ensuite faire jusqu'à 2,0 ml avec de l' hexane. SPE nettoyage Fixer sacs jetables de soupapes, cartouches aminopropyle, et les réservoirs de la cartouche au collecteur SPE. Mettre 10 ml des flacons de collecte de verre sèches et propres dans le rack et place à l'intérieur du collecteur d'extraction. Pipette 2 ml d'hexane dans chaque réservoir, pour conditionner les cartouches. Permettre au liquide de passer à travers les cartouches. Pipeter l'extrait d'échantillon dans le réservoir de CPG et encore permettre au liquide depasser à travers la cartouche. Recueillir l'échantillon éluat dans le flacon et retirer du collecteur. Ne pas jeter éluat. Mettre un nouveau flacon sec 10 ml de collection propre dans rack et placer à l'intérieur du collecteur d'extraction. Laver la cartouche, ajouter 2 ml d'acétate d'éthyle dans de l'hexane (30% v / v) dans le réservoir et extraire le liquide à travers la cartouche. Répéter l'opération avec encore 2 ml d'acétate d'éthyle dans de l'hexane, en éliminant tous les lavages. Placer le 10 ml collection flacon d'origine (étape 1.2.3.2) retour dans le rack à l'intérieur du collecteur d'extraction. Introduire à la pipette 2 ml d'acétate d'éthyle dans de l'acétone (50% v / v) dans le réservoir, mettre la pompe à vide (au-dessous de 2 poHg pour permettre à un taux inférieur à 2 ml par minute) et tirer le liquide à travers dans la fiole . Répétez le processus avec un autre 2 ml d'acétate d'éthyle. Retirer le flacon d'échantillon et en utilisant un concentrateur pour réduire le volume d'extrait d'1 ml. Transférer l'échantillon dans un flacon de verre plus petit et utiliser de l'azote chablis équipement, pour évaporer til extrait à siccité naissante. Ajouter 100 ul de méthanol et bien mélanger. Transférer l'extrait à un échantillonneur automatique flacon (avec 0,3 ml insert) et boucher le flacon. Analyser les échantillons en utilisant LCMS / MS (voir la section 2). Colonne: PL gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 um Garde Colonne: gel PL, 50 x 7,5 mm, 5 um Phase mobile: dichlorométhane Débit: 1 ml par minute Température de la colonne: 25 ° C, Détecteur UV: 210 nm Volume d'injection: 95 pi Mode d'injection: Supporterard Dessinez vitesse: 500 ml par min Ejecter vitesse: 500 ml par min Position Draw: 3 mm, La fraction recueillie: 3 ml de la fraction (7-10 min) dans des flacons de 10 ml Tableau 1. Conditions et paramètres de chromatographie sur gel perméable (GPC) nettoyage des échantillons d'eaux usées extraites. Tableau de détails colonne GPC, phase mobile, la température, le volume d'injection, et le détecteur de longueur d' onde. extraction de l'échantillon (pour écran Yeast Estrogen) Filtrer les échantillons que détaillés dans la section 1.2.1.1. Attacher sacs jetables, des cartouches de valve SPE C18 et les réservoirs de la cartouche dans l'appareil de SPE. Mettre la pompe à vide pour tester l'équipement est convenablement scellé. Pipette 5 ml de méthanol dans chaque réservoir, pour conditionner le C18 cartouches. Allumez le vide (à environ 5 inHg pour permettre un débit d'environ 5 ml par minute) et laisser le liquide à travers, faisant une pause pendant 1 min à mi-chemin à travers. Ne laissez pas les cartouches sont à sec. Répéter les opérations avec soit de qualité HPLC ou de l' eau distillée deux fois (ddH 2 O). Encore une fois ne fonctionne pas à sec. Extraire des échantillons d'eau, comme décrit dans la section 1.2.1.4. Poursuivre le vide pendant au moins 30 minutes pour sécher les cartouches. Placer les flacons de collecte de 10 ml propre et sec dans un rack dans le collecteur d'extraction. Vérifiez que chaque chemise est au-dessus d'un flacon. Ajouter 5 ml de methanol à chaque réservoir. Allumez le vide (débit maximal de 5 ml / min) et laisser passer le liquide à travers la cartouche dans le flacon, une pause pendant 2 min à mi-chemin à travers. Avant l'analyse en utilisant l'écran OUI, réduire l'extrait à siccité naissante en utilisant l'azote et reconstituer avec 500-1000 ul d'éthanol. Sceller les couvercles des flacons d'échantillons pour éviter l'évaporation et de garder à 4 ° C (dans un sans étincellesfrigo). 2. Analyse chimique utilisant LCMS / MS Optimiser les conditions de fonctionnement du système LCMS / MS en utilisant les instructions du fabricant. Analyser les solutions d'étalonnage standard, les extraits d'échantillons, le contrôle vierge et qualité analytique (AQC) échantillons en utilisant la chromatographie en phase liquide et les conditions de spectrométrie de masse, et de surveiller les transitions d'ions comme indiqué dans le tableau 2. Déterminer la concentration d'oestrogènes stéroïdes dans l'extrait d'échantillon à l' aide interne 10 normes. LCMS chromatographie liquide Colonne: C18 (2), 150 x 4,6 mm, 5 um. Volume d'injection: 20 ul Écoulement: 0,5 ml par minute. Mla phase obile: Solvant A: eau contenant 0,1% d'ammoniaque. Solvant B: acétonitrile. programme Gradient: Temps (min) 0 dix 18 24 28 A: B taux de solvant 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00 Spectrométrie de masse La source: Electrospray (ion négatif) Gaz et source: CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi TEM: 600 ° C, CAD gaz 5 et Ionspray tension -900 transitions MRM: </td> E1: 269/145 et 269/143 E2: 271/145 et 271/143 EE2: 295/145 et 295/143 E1-D4: 273/147 E2-D4: 275/147 EE2-D4: 299/145 Tableau 2. Détails paramètres et conditions pour l' analyse des oestrogènes stéroïdes dans des extraits d'eaux usées LCMS / MS. Le tableau donne le volume d'injection échantillon et le débit, les conditions de la phase mobile and gradient. 3. Activité œstrogénique Utilisation in vitro écran Yeast Estrogen (YES) Assay 8 Préparer et stocker un minimum de moyennes et moyennes des composants selon le tableau 3 (a) à (g). (a) Medium Minimal (pH 7,1): Préparer un alliage Fe 2 (SO 4) 3 par addition d'une solution de 40 mg de Fe 2 (SO 4) 3 à 50 ml d'eau bidistillée (ddH 2 O) Ajouter 1 L ddH 2 O à un 2 L bêcher en verre Ajouter les composants suivants dans le bêcher: 13,61 g KH 2 PO 4 1,98 g (NH 4) 2 SO 4 4,2 g de KOH 0,2 g MgSO4 1 ml de Fe 2 (SO 4) <sub> 3 solution 50 mg de L-leucine 50 mg de L-histidine 50 adénine mg 20 mg de L-arginine-HCl 20 mg de L-méthionine 30 mg de L-tyrosine 30 mg de L-isoleucine 30 mg de L-lysine-HCl 25 mg de L-phénylalanine l'acide 100 mg L-glutamique 150 mg de L-valine 375 mg de L-sérine Placer le bécher sur un agitateur chauffé avec une puce magnétique et remuer jusqu'à ce qu'il soit tout dissous Vérifier que le pH est de 7,1 et d'ajuster si nécessaire En utilisant une seringue stérile de 50 ml distribuer 45 ml aliquotes dans des bouteilles en verre avec couvercles à vis métallique Stériliser le milieu minimal à 121 ° C pendant 10 min dans un autoclave Ranger à température ambiante (b) D – (+) – Glucose: Préparer une solution à 20% p / v dans ddH 2 O Distribuer 20 ml aliquotes dans des flacons de verre avec couvercles à vis métallique Stériliser la solution de glucose à 121 ° C pendant 10 min dans un autoclave Ranger à température ambiante (c) Acide L-aspartique: Faire une solution mère de 4 mg / ml dans ddH 2 O Distribuer 20 ml aliquotes dans des flacons de verre avec couvercles à vis métallique Stériliser la solution acide L-aspartique à 121 ° C pendant 10 min dans un autoclave Ranger à température ambiante (d) Solution de vitamine: Préparer une solution de biotine par addition de 2 mg de biotine à 100 ml d'ddH 2 O Peser 8 mg de thiamine, 8 mg de pyridoxine, l'acide pantothénique 8 mg, 40 mg d'inositol. Ajouter tous les composants secs et 20 ml de solution de biotine à 180 ml ​​ddH 2 O Faire aliquotes de 10 ml stérile par filtration à travers un 0,2 um de taille de pores filtre jetable dans des flacons en verre stériles dans une hotte à flux laminaire d'air Conserver à 4 ° C (e) L-Thréonine: Préparer 100 ml de 24 mg / ml de L-thréonine dans ddH 2 O Distribuer 10 ml aliquotes dans des flacons de verre avec couvercles à vis métallique Stériliser la solution de L-thréonine à 121 ° C pendant 10 min dans un autoclave Ranger à température ambiante <stRong> (f), cuivre (II) Sulfate: Préparer 25 ml d'une 20 mM de cuivre (II) dans une solution de sulfate ddH 2 O Faire aliquotes de 5 ml stérile par filtration à travers un filtre de 0,2 um de taille de pore dans des flacons stériles en verre, dans une enceinte à flux laminaire Ranger à température ambiante (g) le rouge de chlorophénol-β-D-galactopyranoside (CPRG): Préparer 25 ml d'une solution à 10 mg / ml de CPRG dans ddH 2 O Faire aliquotes de 5 ml stérile par filtration à travers un filtre de 0,2 um de taille de pore dans des flacons stériles en verre, dans une enceinte à flux laminaire Conserver à 4 ° C Tableau test de l' écran Estrogen 3. Yeast; préparation et le stockage des minimales moyennes et moyennes composants. Préparation et storage de 10x culture de levure concentrée Le jour 1, préparer le milieu de croissance (comme détaillé dans 3.4.1) et verser dans un flacon conique stérile. Ajouter 125 pi de 10x levure concentrée du flacon cryogénique stocké à -20 ° C. Incuber les milieux inoculés à 28 ° C pendant environ 24 heures sur un agitateur orbital. Le jour 2, faire deux bouteilles de milieu de croissance (~ 50 ml) et verser dans des flacons coniques stériles séparés. Ajouter 1 ml de 24 heures de culture de levure dans chaque flacon de milieu de croissance. Incuber les milieux inoculés à 28 ° C pendant environ 24 heures sur un agitateur orbital. Au jour 3, verser chaque culture de 24 heures dans un tube de centrifugeuse de 50 ml stérile. Centrifuger les tubes de 50 ml à 4 ° C pendant 10 min à 2000 x g. Verser le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 5 ml de milieu minimal avec 15% de glycérol. Faire aliquotes de 0,5 ml de la culture de levure concentrée 10x dans 1,2 ml cryotubes stériles et conserver à -20 ° C pour une durée maximale de 4 mois. Preparation et de stockage des stocks de produits chimiques pour les courbes standards Rincer la verrerie et les spatules deux fois avec de l'éthanol absolu et laisser sécher avant de l'utiliser pour éliminer toute trace de contaminants. Peser E2 directement dans un flacon en verre dans une enceinte de pesage de poudre et d'ajuster la concentration en volume dans l'éthanol absolu. Diluer à une concentration de 2×10 -7 M (54,48 mg / L). couvercle de Seal et conserver à 4 ° C (dans un réfrigérateur sans étincelles). producteur Assay Au jour 0, préparer un milieu de croissance. À la bouteille de milieu minimal de 45 ml, ajouter 5 ml de solution de glucose, une solution d'acide L-aspartique 1,25 ml, 0,5 ml de solution de vitamines, 0,4 ml de solution de L-thréonine, et 125 ul de cuivre (II), une solution de sulfate. Verser le milieu de croissance dans une fiole conique stérile. Ajouter 125 pi de 10x mère concentrée (décongelé de -20 ° C stockage) dans le flacon et incuber les milieux inoculés à 28 ° C pendant environ 24 heures sur un agitateur orbital. Le jour 1, étiqueter un 96 puits «plaque de dilution» stérile et faire des dilutions en série (100 volumes ul dans de l' éthanol) de E2 courbe standard et chimique (s) de test / extrait de l' effluent (s) (par exemple, EE2). Étiquette stérile de 96 puits à fond plat optiquement 'plaque (s) d'essai »de microtitrage. Sur chaque plaque comprennent des blancs (plus / moins de solvant) et une courbe standard E2, en plus des lignes de produits chimiques (s) de test / extrait (s) de l'effluent. Introduire à la pipette 10 ul de chaque concentration (E2, chimique ou extrait) dans le puits approprié de la plaque d'essai. Pipette 10 pi d'éthanol dans chaque «solvant blanc» et de la plaque d'essai. Laisser la plaque test avec le couvercle pour évaporer à sec. Faire une bouteille de milieu de croissance (~ 50 ml) et ajouter du rouge-β-D-galactopyranoside (GPRC) solution par bouteille de 0,5 ml de chlorophénol. Déterminer la densité des cellules de levure dans la culture de 24 heures en mesurant la turbidité de la culture à 620 nm dans un lecteur de plaque. Inoculer l'unmoyen éssayé avec 4×10 cellules de levure 7 de la culture de 24 h. Verser milieu d'essai inoculé dans une cuve stérile. En utilisant une pipette à canaux multiples ajouter 200 ul de milieu de test inoculé à chaque puits de la plaque de dosage à 96 puits. Mettez le couvercle sur la plaque d'essai de 96 puits et sceller les bords avec du ruban adhésif. Agiter la plaque (s) d'essai vigoureusement pendant 2 min sur un agitateur de plaque de titration et incuber à 32 ° C dans une étuve à ventilation naturelle. Le jour 2, agiter la plaque (s) d'essai vigoureusement sur un agitateur de plaque de titration pendant 2 min. Retour à 32 ° C incubateur. Le jour 4, agiter la plaque (s) d'essai vigoureusement pendant 2 min sur un agitateur de plaque de titrage. Laissez la plaque (s) au repos pendant environ 1 heure puis de lire la plaque (s) d'essai à une absorbance de 540 nm (absorbance optimale pour CPRG ~ 575 nm) et 620 nm (pour la turbidité) en utilisant un lecteur de plaque. Laissez plaque (s) à la température ambiante et de lire plus tard si nécessaire. activité oestrogénique calculs <ol> lectures correctes d'essai pour la turbidité à l'aide de l'équation suivante: Correction value = échantillon ou standard (E2) absorbance à 540 nm – [échantillon ou (E2) absorbance standard à 620 nm – absorbance du blanc à 620 nm]. Plot E2 courbe standard avec des espaces appropriés (pour vérifier la contamination) 8. Utilisez l'échantillon corrigé (extrait ou chimique) pour calculer «équivalents estradiol». Utilisez les E2 valeurs de courbe standard tracée et l'équation de régression (3-paramètre polynôme ou linéaire en fonction de l'ajustement) pour interpoler l'échantillon / extraire des valeurs d'absorbance à des valeurs équivalentes E2. Utilisez le facteur de concentration ( à savoir, l' eau extraite et le volume d'éthanol , l'extrait est remis en suspension dans) pour calculer l' activité oestrogénique dans l' échantillon pré-extrait. 4. Laboratoire d' évaluation basée sur des activité œstrogène Utilisation In Vivo Vitellogenin Induction in Male Fathead ménés Utilisez vairons mâles (Pimephalespromelas)> 4 mois, qui présentent des caractéristiques sexuelles secondaires ( par exemple, le développement de perliformes et fatpad dorsale) indiquant la détermination sexuelle masculine. Pour empêcher l'activité de frai, mature séparée mâles trois semaines (± 3 jours) avant le début de l'essai. Mettre en place au moins deux 45 L aquariums en verre avec une charge maximale de 3 g / L. Pour assurer un nombre suffisant de poissons en bonne santé pour le test, utiliser un minimum de 100 hommes. Gardez le poisson mâle dans des conditions environnementales identiques seront expérimentés dans le test (ie, température de l' eau de 25 ± 1 ° C et 16: la lumière de 8 heures: photopériode foncé). Maintenir le débit d'eau de dilution dans chaque réservoir pour assurer un temps de remplacement de 95% d'au moins tous les 6 à 8 heures, soit 330 ml / min pour un réservoir de 45 L. Appareil d'essai et la conception expérimentale Utiliser de grands réservoirs de verre pour accueillir une charge allant jusqu'à 3 g de poisson par litre de water. Pour 8 mâles adultes (nominalement 4,5 g chacun), utiliser un réservoir de 10-20 L. Utilisez deux réservoirs répétés pour chaque traitement et protéger chaque réservoir de toutes les perturbations visuelles inutiles (c. -à- utiliser des écrans de cartes laminées entre les réservoirs). Identifier chaque réservoir avec un certain nombre d'études, une concentration d'exposition et un numéro d'identification du navire. Pour les études effluents d'eaux usées À l'arrivée, transférer immédiatement l'effluent dans un réservoir de stockage à 10 ± 1 ° C. Commencer le dosage des effluents à l'intérieur de deux h de réception de l'effluent. Nourrissez l'effluent, par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique, à partir du réservoir de stockage C 10 ° à un navire d'acclimatation. Chauffer l'effluent dans la cuve d'acclimatation à 18 ± 2 ° C. Pomper l'effluent chauffé de la cuve d'acclimatation aux récipients de mélange / dosage, puis à l'aquariums d'essai (qui contient le poisson). Chauffer les aquariums à une température de 25 ± 1 ° C. Pour les études de dosage chimiques Peser les produits chimiques d'essai dans une enceinte de pesage de poudre. Préparer des stocks de produits chimiques concentrés dans ddH 2 O de préférence , sans l'utilisation de solvants. Remarque: Si des solvants sont nécessaires pour solubiliser les composés d'essai, l'utilisation des contrôles de solvant, en plus du contrôle de l'eau de dilution. alimentation par gravité ou de l'eau de dilution de la pompe à partir d'une température contrôlée tête réservoir via un dispositif (s) de contrôle de débit de dosage / cuve de mélange. Pompe concentrée stock (s) chimique en utilisant un système de pompage péristaltique pour le dosage / mélange des navires. Contrôler le débit de la pompe (de stock chimique) et le débit d'eau (eau de dilution) pour obtenir la concentration d'exposition souhaitée. Remarque: Utilisez un tube de silicone pour nourrir chimique de l'eau / de test pour chaque récipient d'essai à partir du dosage / cuve de mélange. Utiliser un débit qui est suffisant pour fournir un remplacement de la cuve à 75% dans au moins 24 heures, soit 20 ml / min pour un réservoir de 20 litres. Maintenir le débit à ± 10% de la valeur nominale spécifiée. </li> Maintenir l' exposition à la température de l' eau du réservoir à 25 ± 1 ° C, l' oxygène dissous au dessus de 70% de la valeur de saturation d'air (5,8 mg L -1 à 25 ° C) et à ± 0,5 unité de pH (pH de départ compris entre 6,5 et 8,5) tout au long de l' étude. Définir les conditions d'éclairage à la photopériode de lumière 16 h: 8 h sombre, avec des périodes de transition / crépuscule à l'aube de 20 min. Nourrir les poissons deux fois par jour avec fraîchement décongelé adultes congelées crevettes de saumure (Artemia) à 2,5 (± 0,1) g par réservoir par alimentation. Aussi nourrir les poissons une fois par jour avec une petite quantité (deux de pincement des doigts) d'un aliment tropical de poissons en flocons. Laisser un minimum de 3 heures entre chaque repas. Gardez une trace de l'alimentation quotidienne pour surveiller la réponse d'alimentation / comportement (bon, modéré ou faible, par rapport aux témoins). Siphonner les réservoirs au moins deux fois par semaine (de préférence tous les jours) pour enlever toute la nourriture et les fèces uneaten. Nettoyer les côtés et le fond des récipients d'essai au moins une fois par semaine. Prendre un échantillon d'eau hebdomadaires de chaque citerne pour confirmer l'activité œstrogénique (via l'écran de levure) et de la composition chimique (via la chimie analytique). Voir les sections 1-3 pour les détails de l'échantillonnage de l'eau, l'extraction et l'analyse. Remarque: Pour chaque expérience, utilisez le contrôle de dilution de l'eau (contrôle négatif), le contrôle positif (E2 ou EE2) plus au moins trois dilutions d'effluents (100, 50 et 25%) ou chimique de test pour surveiller la réponse de dose. Si de nouvelles technologies sont testées, utilisez composé / effluent avec ou sans traitement (par exemple, EE2 sans traitement, EE2 avec TAML / peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) traitement 12; Figure 1). Figure 1. Schéma représentant la conception expérimentale d'un essai biologique in vivo Vairon à grosse tête vitellogénine pour déterminer le retrait de l' écotoxicité de 17α-éthinylestradiol utilisant TAML / traitement de l' eau de peroxyde. L'experimental mis en place se compose de huit 11 L verre chaque aquarium nourris avec un flux continu d'eau. solutions chimiques d'actions individuelles et de l'eau (filtrée de-chloré) sont livrés aux chambres de mélange. Des concentrations nominales (sans réaction) dans les récipients de mélange sont de 2 ng / L EE2, 80 nM TAML et 0,16 pg / LH 2 O 2. Solutions chimiques d'achat d'actions (EE2, H 2 O 2 et TAML) sont préparés et dosés séparément afin que les réactions commencent dans les récipients de mélange. Poisson (8 vairons mâles par réservoir) sont exposés au mélange (s) après un temps d'environ 45 minutes de contact de réaction. Des échantillons d'eau sont prélevés dans les réservoirs d'exposition hebdomadaire. Les échantillons de plasma sont prélevés vairons pour mesurer la vitellogénine biomarqueur oestrogénique (VTG) à partir d'un groupe de référence, au début de l'étude, et tous les autres poissons après 21 jours d'exposition. Les traitements spécifiques sont les suivants: 'C'; contrôle négatif (eau de dilution uniquement), '+'; contrôle positif de EE2,'+ H'; EE2 plus H 2 O 2 '+ T'; EE2 plus H 2 O 2 plus TAML. Ce chiffre a été modifié depuis Mills et al. 2015 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Procédure de test période d'acclimatation Mesurer le poids humide (g) de chaque poisson mâle sexuellement mature, et allouer au hasard pour chaque réservoir (8 mâles par réservoir). Gardez le poisson non alloué du même lot et de les maintenir dans les mêmes conditions de test. Utilisez ces poissons pour remplacer les personnes qui présentent des signes de dommages physiques ou un manque de condition pendant la période d'acclimatation de 7 jours. S'assurer à la fin de la période d'acclimatation de chaque réservoir de traitement a 8 hommes qui ont pleinement acclimatés aux conditions d'essai. Prenez des échantillons de plasma "de base" de un 8 hommes supplémentaires de la même batch des poissons mâles. Suivez la méthode de prélèvement de sang dans la section 4.4 et la méthode Vitellogenin (VTG) d'analyse en 4.5. Après la période d'acclimatation, de livrer les stocks de dosage des effluents chimiques ou aux réservoirs d'exposition pendant 21 jours comme décrit au point 4.2.2 ou 4.2.3. mortalité Monitor, le comportement et l'apparence physique des poissons dans chaque répliquent réservoir quotidiennement avant la première alimentation de la journée. Notez tout comportement anormal ou incidents. Remarque: Veiller à des conditions environnementales et les taux d'alimentation maintiennent la santé des poissons (sections 4.2.4 et 4.2.5). Poisson d'échantillonnage après la période d'exposition de 21 jours 12 h avant le prélèvement, arrêter l'alimentation des poissons. tubes micro-centrifugeuse étiquette pour la collecte des échantillons de sang, ajouter ~ 5 pi d'aprotinine (un inhibiteur de la protéase) et placez-les sur la glace. Faire une solution de 500 mg / L de MS222 (anesthésique) par dissolution de 500 mg de MS222 par 1 L d'eau de-chloré (anciennement acclimatésà 25 ± 1 ° C). Neutraliser le MS222 à pH 7,4 ± 0,4 en utilisant 1 M NaOH. Déplacer chaque poisson du réservoir dans le MS222 tamponnée. Gardez à la solution jusqu'à ce que la cessation de tout mouvement opercule (typiquement 5 ± 1 min). Mesurer et enregistrer la longueur de la fourche (mm) sous l'anesthésique terminal. Utiliser un scalpel jetable pour amputer la queue, et d' utiliser un tube hématocrite hépariné pour recueillir le sang de l'artère caudale (Figure 2). passer soigneusement le sang dans le tube à centrifuger pré-étiquetés et garder sur la glace. Tuer le poisson immédiatement après avoir dessiné le sang. Confirmer la mort par arrêt définitif de la circulation et / ou la destruction du cerveau. Mesurer et noter le poids total du poisson (le plus proche de 0,01 g), et de disséquer les tissus selon les besoins. Centrifuger le sang (7000 xg pendant 5 min à 4 ° C) dans les 2 heures de la collecte. Transférer le surnageant de plasma à l'aide d'une pipette dans un nouveau marqué 0,4 ml microcentrifugeuse baignoirees et de stocker sur la glace. Congeler les tubes contenant du plasma sur glace sèche dans les 30 minutes de centrifugation et conserver à -80 ° C avant l'analyse des concentrations plasmatiques de VTG. Figure 2. Photos représentant vairon mâle fathead (Pimephales promelas), la collecte et l' emplacement du testis plasma. A la fin de l'exposition de 21 jours tous les poissons devraient être tués pour prélever des échantillons de sang. Une fois sous cette longueur terminale anesthésique de poisson (longueur à la fourche, mm) doit être mesuré, rapidement suivie par la collecte de sang de l'artère caudale Photo-A:. ​​Ligne pointillée rouge indique l' emplacement de la queue amputation (un scalpel jetable doit être utilisé pour amputer la queue ). photo-B montre un tube hématocrite hépariné utilisé pour recueillir le sang. Chaque poisson doit ensuite être tué immédiatement après son échantillon de sang a été prise, dans ce cas, toute la têtea été séparée du corps (Photo-C). Une fois que le poisson a été tué la cavité du corps peut être ouvert pour révéler les organes internes. Photo-C montre l'emplacement du testicule (gonades) par rapport à la vessie natatoire (SB) dans les poissons cyprinidés, par exemple, Vairon à grosse tête, le gardon, la carpe, etc. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Mesurer les concentrations plasmatiques de VTG avec une enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit VTG homologue conçu spécifiquement pour les vairons. Préparer des normes et des tampons VTG tel que décrit dans le protocole du fabricant. Diluer plasma échantillon 1:50, 1: 5000 et 1: 500.000 et doser les en double exemplaire pour obtenir des lectures dans la plage de courbe standard VTG selon les instructions du fabricant. Suivez les directives du fabricant pour calculer les concentrations de vitellogénine. </li> 5. Les évaluations sur le terrain de Advanced / Novel Wastewater Treatment Technologies pour atténuer l' activité œstrogène Utilisation de In Vivo Vitellogenin et intersexe Induction dans Roach (Rutilus rutilus) Capture of wild gardon vivant en aval des exutoires Wastewater Treatment Plant Remarque: Utilisez le gardon (Rutilus rutilus) ou d' autres espèces d'eau douce en abondance ou de poissons saumâtres, qui sont gonochorique et connu pour être sensible à la perturbation endocrinienne oestrogénique. Attrapez des poissons en utilisant électropêche, des filets, le piégeage ou d' autres méthodes de pêche reconnues selon la situation 13. Transporter le poisson dans les réservoirs aérés retour au laboratoire pour l'échantillonnage. Préparer des tubes de microcentrifugation comme indiqué dans 4.4.2. Préparer tamponnée MS222 comme décrit dans 4.4.3. Anesthetize poissons comme détaillé dans 4.4.4. Mesurer la longueur du poisson et le poids sous anesthésie terminal. Prélever le sang de la caudale artère en utilisant disposeringue héparinée zibeline. Tuez chaque poisson immédiatement après le prélèvement d'échantillons de sang. passer soigneusement le sang dans des tubes à centrifuger pré-étiquetés et garder sur la glace. Préparer le plasma comme décrit dans l'étape 4.4.7 et mesurer VTG par ELISA (4,5). En utilisant des pinces enlever les écailles de poisson 2-3 de chaque poisson et placez dans de petites enveloppes de papier marqués individuellement. Stockez les enveloppes à la température ambiante dans des conditions sèches pour les poissons plus tard détermination de l'âge et de l'analyse de la croissance. cavité corporelle ouverte avec un scalpel pour faire apparaître les organes internes. Sortez l'intestin pour révéler la vessie natatoire avec un gonades situé de chaque côté (Figure 2). Retirez délicatement les gonades appariés avec une pince à bec fin et lieu dans un flacon en verre. Couvrir les gonades avec le fixateur de Bouin à un rapport de 1:10 tissu: fixatif. Laissez le tissu dans Bouin pour 6-24 heures en fonction de la taille du tissu (fixateur pénètre à 1 mm par heure). Une fois fixé, verser fixateur de l'un BouinD remplacer par 70% de l'alcool dénaturé (IMS). Stocker le tissu fixé à la température ambiante jusqu'à ce que les tissus sont traités pour l'histopathologie (section 5.3). Champ évaluation fondée de l' activité oestrogénique in vivo en utilisant vitellogénine et intersexuées induction dans le gardon Design expérimental et mis en place Remarque: Mettre en place les réservoirs et usine pilote bien avant le travail vivo départ dans. Démarrez les réservoirs qui coule 3-4 semaines avant tout ajout de poissons au système. Surveiller les débits d'eau, la qualité et les conditions (pH, température, oxygène dissous, etc.) régulièrement pour vous assurer des paramètres de l' eau peut être maintenue. Construire de grands réservoirs d' eau du robinet (par exemple, 300-1000 L) sur le site de l'usine pilote, qui peut recevoir le «contrôle» de-chloré, effluent traité standard (s) et avancé des effluents (s) traité en parallèle. Fixer la pompe à air / aérateurs dans les réservoirs. Définir des débits d'eau pour atteindre au moins 6 réservoir véchanges olume par jour. Remarque: Assurez-vous que les réservoirs sont bien isolés et ombragés pour éviter des fluctuations excessives de température quotidiennes. Les réservoirs de conception pour permettre une observation du poisson, des altérations du comportement (en absence d'alimentation, etc.), des signes de maladie et de mortalité. Démarrez l'exposition en faisant flotter les sacs de roach (de la ferme de poissons) dans les réservoirs respectifs pendant 1 h. Ajouter de l'eau du réservoir pour les sacs progressivement jusqu'à ce que la température de l'eau et les conditions sont ambiante. Relâchez le poisson dans leurs réservoirs. Nourrissez roach adulte par jour sur la nourriture des poissons granulés (taille 0,5-0,8). Nourrissez roach juvénile quotidienne sur les petits granulés (tailles de granulés 100-300) non-oestrogénique alimentation 14 ad libitum, ajusté sur la base d'aliments non consommés. Tenir un registre d'alimentation réponse documentant d'alimentation / comportement quotidien (bonne, moyenne ou mauvaise, par rapport aux témoins). Prélever des échantillons d'eau hebdomadaires de chaque citerne pour confirmer l'activité oestrogénique et la composition chimique. Sesections e 1-3 pour les détails des méthodes d'échantillonnage et d'analyse de l'eau. Histopathologie des poissons gonades 15 Retirez délicatement les gonades disséquées et fixes (décrites dans les étapes 5.1.6 et 5.1.7) du récipient avec des pinces et les placer sur une planche à découper. Utilisez une lame microtome pour couper chaque gonades en 3 parties (antérieure, moyenne et postérieure) et à partir de chaque partie coupé une section transversale d'épaisseur de 3-5 mm. Placez soigneusement les six morceaux dans une cassette de biopsie plastique étiqueté, et la placer dans le processeur de tissus en utilisant les timings énumérés dans le tableau 4. Wax tissus et section sur microtome rotatif (3-5 pm) incorporer. sections de transfert aux étiquetés lames de verre enduit bio-adhésif et placer les lames sur une plaque chauffée (fixée à 45 ° C) à sécher pendant 24 heures. Colorer les lames, soit manuellement , soit à l' aide d' une coloration automatisée, en utilisant les horaires détaillés dans le tableau 5. Déposer une goutte d'agent de fixation sur le tissu teinté, et lay un verre Coverslip sur l'agent de montage pour protéger le tissu. Tout d' abord, examiner chaque lame à faible grossissement (20X, ie objectif 2X, avec des lignes 10X oculaires grossissement) pour déterminer le sexe et le nombre de points de pièces jointes à la cavité du corps 15. Notez toutes les anomalies pour chaque poisson. A un plus fort grossissement (100X ou 400X), examiner les tissus pour évaluer les stades de la gamétogenèse, des anomalies et la présence d'ovocytes dans le tissu testiculaire. Notez la gravité de l' intersexualité avec le système suivant de notation allant de 0 (tissu mâle normal) à 7 (100% tissu ovarien) 6 (voir le tableau 6). Numéro de l' étape Traitement Objectif Temps (h) 1 70% IMS déshydration 3 2 90% IMS déshydration 2.5 3 95% IMS déshydration 1.5 4 100% IMS déshydration 1.5 5 100% IMS déshydration 1.5 6 100% IMS déshydration 1.5 7 100% IMS déshydration 1.5 8 Histologie agent de compensation Clairière 1.5 9 Histologie agent de compensation Clairière 1.5 dix Histologie agent de compensation Clairière 1.5 11 LA CIRE Wax infiltration 1.25 12 LA CIRE Wax infiltration 1.25 20 h TOTAL Tableau 4. régime de traitement pour la cire d' imprégnation des tissus pour l' histopathologie. Les tissus doivent être traités dans un processeur automatique de tissu. Les tissus doivent être immergés dans les solutions détaillées pour la période de temps spécifiée. Colorer pas. Tache Objectif Temps (min) 1 Agent histologie Compensateur Dissout la cire 15 2 <td> 100% IMS hydration 2 3 90% IMS hydration 2 4 70% IMS hydration 2 5 EAU DU ROBINET (RUNNING) Rincer 2 6 hématoxyline noyaux cellulaires Taches bleu dix 7 EAU DU ROBINET (RUNNING) Enlever l'excès dix 8 acidifiés IMS déchloration 20 sec 9 EAU DU ROBINET (RUNNING) Rincer 20 sec dix LiCO 3 Sel 20 sec 11 EAU DU ROBINET (RUNNING) Rincer 20 sec 12 1% EOSIN (AQUEUSE) Taches roses cytoplasme 20 sec 13 EAU DU ROBINET (RUNNING) Enlever l'excès 5 14 70% IMS déshydration 2 15 90% IMS déshydration 2 16 100% IMS déshydration 5 17 Agent histologie Compensateur Retirer IMS, agent de liaison 5 Tableau 5. Solutions et temps d'immersion pour hématoxyline et de l' éosine (H & E) coloration des tissus du poisson gonadiques. Les lames doivent être placés dans chaque bain pour le allocATED temps en séquence. H & E coloration des tissus est nécessaire pour déterminer les impacts du développement ou de l'organisation des effluents d'eaux usées oestrogéniques sur les gonades poissons. But Section description 0 testis mâle normal 1 Multifocale ovotestis avec 1-5 ovocytes (habituellement individuellement) dispersés dans le tissu testiculaire 2 ovotestis multifocale, 6-20 oocytes souvent en petites grappes dispersées entre le tissu testiculaire 3 ovotestis multifocale, 21-50 oocytes en grappes 4 > 50 et <100 ovocytes. Section est habituellement multifocale et a l'apparence d'une mosaïque de teststissus iculier et de l'ovaire. 5 > 100 ovocytes, habituellement multifocale mais pourrait aussi être focale avec des zones clairement identifiables de tissu ovarien et testiculaire séparé du tissu testiculaire. 6 > 50 pour cent du tissu gonadique sur la section est de l'ovaire et est clairement séparé du tissu testiculaire par les cellules épithéliales et les tissus phagocytaires. 7 100 pour cent des tissus gonadiques sur la section de l'ovaire. Tableau 6. Système de notation pour évaluer la gravité de l' état ​​de l' intersexualité dans le gardon. Histologiquement lames préparées de tissu gonadique devraient être examinées au microscope optique, à 20X, 100X et 400X, pour évaluer d' éventuelles anomalies et la présence d'ovocytes dans le tissu testiculaire. Ce tableau est modifié à partir Jobling <em> et al. 2006 6.