Atıksu Arıtma Süreçlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi için Kimya ve Ekotoksikolojik Yöntemlerinin bir pil kullanılması östrojenik Potency çıkarmak

Etik bildirimi: balık kimyasallar / karışımların aktivitesini bozarak endokrin değerlendirmek için protokoller Brunel University Londra'nın Hayvan Refahı tarafından tescil edildi Hayvanlar altında Etik İnceleme Vücut (AWERB) ve İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986. 1. Su Numune Toplama, Muhafaza ve Ekstraksiyon Örnek toplama ve koruma uygun bir yüzey aktif temizleme maddesi ile şişe kullanmak temizlemek için önce. Temizlikten sonra, su, drenaj ve kuru şişeleri durulayın. bakır (II) nitrat 0.5 g, 6 ml 3.6 M hidroklorik asit çözeltisi arasında oluşan bir koruyucu ihtiva eden 2-L kapasiteli cam şişe örnekleri toplamak. 10 ° C altında muhafaza örnekleri. Özü ve olası aşağıdaki toplama ve korunması en kısa sürede analiz. Örnek çıkarma ve (steroid östrojen analizi için) temizlik 10 Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) ekstraksiyon öncesinde, 1 mikron gözenek boyutu filtre kağıdı kullanılarak askıda katı madde, filtre su numuneleri azaltmak için. 2,4,16,16-d4 -17β-östradiol (E2): Bir kere d 2,4,16,16 4 -estron içeren döteryumlu iç standart stok solüsyonu spike 100 ul ekleyerek iç standart ile, başak örnekleri süzülmüş : ve 2,4,16,16-d4 -17α-etinilestradiol (EE2) (40 ug metanol / L) 1000 mi çıkışındaki (ya da 100 mi akan) kanalizasyon 2 ng / L iç başak sonuçlanan atık numuneleri ve kanalizasyon içeri giren örnekleri için 20 ng / L. SPE aparatına atılabilir valf gömlekleri, stiren divinil benzen SPE kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. ekipmanı test etmek için vakum pompası açın yeterince mühürlenir. Pipet Her hazne içine etil asetat 5 ml kartuş koşulu. Vakum pompası (10 inHg dakikada en az 10 ml'lik bir akış oranı izin vermek için, aşağıda) geçişve sıvı üzerinden çekin. SPE kartuşları kurumasına izin vermeyin. 5 ml su ve ardından, 5 ml metanol ile tekrarlayın. su ile her bir kartuş haznesi doldurun ve kartuş rezervuar ve cam numune şişeler arasındaki 1/8 "PTFE tüpleri bağlamak. dakikada en az 10 ml'lik bir akış hızında vakum açma ve bütün örnek kartuşu içinden geçmesine izin verir. atık şişesi olarak gerekli boşaltın. İyice (örneğin, koyu kahverengiden açık kahverengi) rengini değiştirmek vakum altında kartuş içeriğinin kadar (hava veya nitrojen kullanarak veya) SPE kartuşları kurutun. Ekstraksiyon manifoldu içindeki raf ve yerine temiz, kuru 10 ml'lik cam toplama şişeleri koyun. Her astar bir şişeye üstünde olduğundan emin olun. Pipet 8 vakum pompası (dakika başına yaklaşık 10 ml akış oranı) ile ilgili her bir örnek rezervuara diklorometan anahtarın ml toplanmasını şişelere sıvı çekin. SPE manifoldundan 10 ml flakon kaldır1 ml hacim azaltmak için yoğunlaştırıcı kullanın. oto-ömekleyici şişesine her bir örnek aktarın ve daha fazla azot blöf ekipmanı kullanılarak 100 ul için konsantre edilir. Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) temizleme . Tablo 1'de tarif edilen koşullar kullanılarak GPC donanımlı HPLC içine akıtılan örnek ekstresinin 95 ul enjekte GPC bir yoğunlaştırıcı ve azot aparatı aşağı darbe ve ardından hekzan ile 2.0 ml makyaj kullanarak 200 ul aşağı ayıklamak Konsantre. SPE temizlik SPE manifolduna atılabilir valf gömlekleri, aminopropil kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. Ekstraksiyon manifoldu içindeki raf ve yerine temiz, kuru 10 ml'lik cam toplama şişeleri koyun. Pipet Her hazne içine heksan 2 mi, kartuş koşulu. Sıvı kartuşları geçmesine izin verin. rezervuar içine GPC örnek özü Pipet ve tekrar sıvı izinKartuşun içinden geçmektedir. flakon örnek eluat toplayın ve manifold kaldırmak. eluat atmayın. rafın içine yeni bir temiz kuru 10 ml toplama flakon koyun ve çıkarma manifoldu içine yerleştirin. Kartuşu yıkama haznesine heksan (% 30 h / h) etil asetat 2 ml ilave edilir ve kartuşu içinden sıvı çekin. Tüm yıkama atarak, heksan etil asetat bir başka 2 ml ile tekrarlayın. geri çıkarma manifoldu içindeki rafa orijinal 10 ml toplama flakon (adım 1.2.3.2) yerleştirin. Pipet aseton, etil asetat 'ın 2 ml (% 50 h / h), rezervuar içine, vakum pompası üzerinde anahtarı ve şişenin içine sıvı haldeki çekme (2 inHg dakikada en az 2 ml' lik bir akış hızı sağlamak için, aşağıda) . etil asetat başka bir 2 ml işlemi tekrarlayın. Numune şişe çıkarın ve 1 ml özü hacmini azaltmak için bir yoğunlaştırıcı kullanın. t buharlaşmasına, ekipman aşağı darbe daha küçük bir cam şişenin içine örnek aktarmak ve azot kullanımıO yeni başlayan kuruyana kadar ayıklayın. metanol, 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. (0.3 mi insert ile) bir otomatik ömekleyici şişesine özü aktarın ve şişe kapağı. LCMS / MS kullanılarak numunelerin analiz (bakınız bölüm 2). Kolon: PL jel, 50 A, 300 x 7.5 mm, 5 um Guard Kolon: PL jel, 50 x 7,5 mm, 5 um Mobil aşama: diklorometan Akış hızı: ve dakika başına 1 mi Kolon sıcaklığı: 25 ° C UV detektörü: 210 nm Enjeksiyon hacmi: 95 ul Enjeksiyon modu: durmakard Çekme hızı: dakika başına 500 mi Hız Çıkar: dakika başına 500 mi Pozisyon çizmek: 3mm Fraksiyon toplanır: 3 mi fraksiyon (7-10 dk), 10 ml şişelerde Tablo 1. ve jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) ile ekstre atık su örneklerinin temizlenmesi için parametreleri. Tablo GPC sütunu, mobil faz, sıcaklık, enjeksiyon hacmi, ve detektör dalga boyu detayları. (Maya Östrojen Ekranı için) örnek çıkarma bölüm 1.2.1.1 olarak detaylı filtre örnekleri. SPE aparatına atılabilir valf gömlekleri, C18 SPE kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. ekipmanı test etmek için vakum pompası açın yeterince mühürlenir. Her hazne içine pipetle 5 ml metanol, C koşullandırılması için18 kartuşları. 1 dak yarım için duraklatma (dakika başına 5 ml'lik bir akış sağlamak için yaklaşık 5 inHg kadar) ve içinden sıvı çalışmasına izin vakum açın. kartuşları kuru çalışmasına izin vermeyin. HPLC notu veya çift distile su ile ya işlemi tekrarlayın (GKD 2 O). Yine kuru çalıştırmayın. bölüm 1.2.1.4 açıklandığı gibi su numuneleri ayıklayın. İyice kartuşları kuru için en az 30 dakika boyunca vakum devam edin. Ekstraksiyon manifoldunda bir rafa temiz, kuru 10 ml toplama şişeleri yerleştirin. Her astar bir şişeye üstünde olduğundan emin olun. Her bir hazneye 5 ml metanol ekleyin. Vakum (5 ml / dak maksimum debi) açın ve sıvı yoluyla 2 dakika yarım için duraklatma, bir şişenin içine kartuşun geçmesine izin verir. Önceki EVET ekranını kullanarak analiz, azot kullanılarak başlangıç ​​kuruyana kadar özü azaltmak ve 500-1,000 ul etanol ile sulandırın. buharlaşmasını önlemek için numune şişeleri kapakları Seal ve (4 ° C'de tutmak bir kıvılcım ücretsizbuzdolabı). LCMS / MS Kullanma 2. Kimyasal Analiz Üreticinin talimatlarını kullanarak LCMS / MS sisteminin çalışma koşullarını optimize edin. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi koşulları kullanılarak kalibrasyon standart çözümler, örnek özleri, boş ve analitik kalite kontrol (AQC) numunelerin analiz ve Tablo 2'de ayrıntılı olarak iyon geçişleri izlemek. İç kullanarak örnek özü steroid östrojenlerin konsantrasyonunu belirleyin standartlar 10. LCMS Sıvı Kromatografisi Kolon: C18 (2) 150 x 4.6 mm, 5 um. Enjeksiyon hacmi: 20 ul debi: dakikada 0.5 mi. MObile aşaması: Çözücü A:% 0.1 amonyak içeren su. Çözücü B: asetonitril. Gradyan programı: Süresi (dak) 0 10 18 24 28 A: B çözücü oranı 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00 Kütle spektrometrisi Kaynak: Elektrosprey (negatif iyon) Gaz ve kaynak: KKO: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi TEM: 600 ° C, CAD gazı, 5 ve IonSpray gerilimi -900 MRM geçişleri: </td> E1: 269/145 ve 269/143 E2: 271/145 ve 271/143 EE2: 295/145 ve 295/143 E1-D4: 273/147 E2-D4: 275/147 EE2-D4: 299/145 Tablo 2. Ayrıntılar parametreleri ve atık su özleri steroid estrojenlerin LCMS / MS analizi için koşullar. Tablo hızı, mobil faz koşulları örnek enjeksiyon hacmi verir ve akışnd degrade. Vitro Maya Östrojen Ekranda Kullanılması 3. östrojenik aktivite (EVET) Tahlili 8 Hazırlayın ve (a) ve (g) Tablo 3 gereğince asgari orta ve orta bileşenlerini saklayın. (a) En az Orta (pH 7.1): Fe 2 (SO4), iki kez damıtılmış su 3-50 ml (GKD 2 O), 40 mg ekleyerek Fe 2 (SO4) 3 solüsyonu hazırlayın Ekle 1 L GKD 2 O 2 L'lik bir cam behere behere aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 13.61 gr KH 2 PO 4 1.98 g (NH4) 2 SO4 4.2 g KOH 0.2 gr MgSO 4 Fe 2 (SO 4) 1 ml <sub> 3 çözüm 50 mg L-lösin 50 mg L-histidin 50 mg adenin 20 mg L-arginin-HCl 20 mg L-metionin 30 mg L-tirosin 30 mg L-izolösin 30 mg L-lisin-HCl 25 mg L-fenilalanin 100 mg L-glutamik asit 150 mg L-valin 375 mg L-serin manyetik bir pire ile ısıtılan karıştırıcı Beher koymak ve tüm çözülene kadar karıştırın pH 7.1 olduğunu kontrol edin ve gerekirse ayarlayın 50 ml'lik steril bir şırınga metal vida En kapaklı cam şişelere 45 ml lik kısımlar halinde tevzi kullanılması bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de minimal ortam sterilize oda sıcaklığında saklayın (b) D – (+) – glikoz: GKD 2 O% 20 ağırlık / hacim solüsyonu hazırlayın metal vida üst kapaklı cam şişe için 20 ml alikotları dağıtın bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C de glukoz çözeltisi sterilize oda sıcaklığında saklayın (c) L-aspartik asit: GKD 2 O 4 mg / ml stok çözeltisi oluşturunuz metal vida üst kapaklı cam şişe için 20 ml alikotları dağıtın bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de, L-Aspartik asit çözeltisi sterilize oda sıcaklığında saklayın (d) Vitamin Çözüm: GKD 2 O 100 ml biyotin 2 mg eklenerek bir biyotin çözeltisi hazırlayın 8 mg tiamin, 8 mg piridoksin, 8 mg pantotenik asit, 40 mg inositol tartılır. 180 mi GKD 2 O tüm kuru bileşenleri ve biyotin çözeltisi 20 ml ekleyin levhalı bir hava akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu atılabilir filtre içinden filtre edilerek, 10 ml steril alikotları yapmak Mağaza 4 ° C (e) L-treonin: GKD 2 O 24 mg / ml L-treonin 100 ml hazırlanması metal vida üst kapaklı cam şişe için 10 ml alikotları dağıtın bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de, L-treonin solüsyonu sterilize oda sıcaklığında saklayın <stRong> (f) bakır (II) sülfat: GKD 2 O 20 mm bakır (II) sülfat çözeltisi 25 ml hazırlamak Laminer akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilerek, 5 ml steril alikotları yapmak oda sıcaklığında saklayın (g) Klorofenol Kırmızı-β-D-galaktopiranosid (CPRG): GKD 2 O CPRG bir 10 mg / ml çözeltisinin 25 ml hazırlamak Laminer akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilerek, 5 ml steril alikotları yapmak Mağaza 4 ° C Tablo 3. Maya Estrojen Ekran deneyi; hazırlanması ve minimal ortam ve orta bileşenlerinin depolanması. Hazırlık ve stora10x konsantre maya kültürü ge 1. gün, büyüme ortamı hazırlamak (3.4.1 ayrıntılı olarak) ve steril bir erlene dökün. -20 ° C'de saklandı kriyojenik şişeden 10x konsantre edildi maya 125 ul ekle. orbital bir karıştırıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de kuluçkaya ortamı inkübe edin. 2. günde, büyüme ortamı (~ 50 mi) iki şişe olmak ve ayrı steril konik şişeler içine dökün. Büyüme ortamı, her şişeye 24 saat kültürlendi maya 1 ml ilave edilir. orbital bir karıştırıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de kuluçkaya ortamı inkübe edin. 3. günde, steril bir 50 ml santrifüj tüpüne her 24 saatlik kültür dökün. 2,000 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje 50 mi borular. Süpernatantı dökün ve% 15 gliserol ile minimal ortamda 5 ml her bir pelet yeniden askıya. 4 aylık bir süre için -20 ° C'de steril cryovials ve mağaza 1.2 ml 10x konsantre edilmiş maya kültürü 0.5 ml'lik alikotları sağlayın. PrepaStandart eğriler için rasyon ve depolama kimyasal stoklarının mutlak etanol ile iki kez tüm cam ve spatula durulayın ve kirlenmektedir herhangi izlerini kaldırmak için kullanılmadan önce kurumaya bırakın. toz ağırlığındaki kabininde bir cam şişenin içine doğrudan E2 tartılır ve mutlak etanol içinde hacimce konsantrasyonunu ayarlamak. 2×10 -7 M (54.48 ug / L) bir konsantrasyona seyreltilir. Mühür kapak ve mağaza 4 ° C'de (bir kıvılcım serbest buzdolabında). tahlil yapımcı 0. günde, büyüme ortamı hazırlar. minimal ortamda 45 ml şişe için 5 ml glükoz solüsyonu, 1.25 mi, L-aspartik asit çözeltisi, 0.5 mL vitamin çözeltisi, 0.4 mi, L-treonin çözeltisi ve 125 ul bakır (II) sülfat çözeltisi ilave edin. steril erlene büyüme ortamı dökün. şişeye (-20 ° C depolama çözüldü) 10x konsantre edilmiş stok 125 ul ilave edin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de İnoküle ortamı inkübe edin. 1. gün, steril 96-iyi 'seyreltme plaka' etiketlemek ve E2 standart eğrinin ve test kimyasal (lar) / çıkış ekstraktı (lar) (örn EE2) içinde (etanol içinde 100 ul hacim) seri dilüsyonları yapmak. Etiket steril 96-de optik düz dipli mikrotitre 'tahlil plaka (ler)'. her bir levha testi kimyasal (lar) / çıkış özü (ler) sıraları ilaveten boşlukları (artı / eksi çözücü) ve bir E2 standart eğri içerir. Pipet deney plakasının uygun kuyuya her bir konsantrasyonu 10 ul (E2, kimyasal veya ekstresi). Pipet deney plakasının her "Çözücü boş" kuyuya etanol 10 ul. kuruyana kadar buharlaşmaya kapak kapalıyken bir deney plakası bırakın. Büyüme ortamı (~ 50 mi) bir şişe yapmak ve şişe başına klorofenol 0.5 mi kırmızı β-D-galaktopiranosid (CPRG) çözeltisi ilave edilir. Bir levha okuyucu içinde 620 nm'deki kültür bulanıklığı ölçülerek 24 saatlik kültür içinde maya hücrelerinin yoğunluğu belirlemek. a aşılamak24 saat kültürden 4×10 7 maya hücreleri ile ssay araç. steril çukur içine inoküle deney ortamı dökün. Çok kanallı bir pipet kullanılarak 96 oyuklu deney plakasının her bir oyuğuna inoküle deney ortamı 200 ul ekle. 96-kuyu tahlil plaka kapağı koymak ve bant ile kenarları mühür. titre plaka karıştırıcısı üzerinde 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde deney plakasının (ler) çalkalanır ve doğal olarak havalandırılan bir ısıtma kabini içinde 32 ° C de inkübe edilir. 2. günde, kuvvetli bir şekilde 2 dakika boyunca bir titre plaka karıştırıcısı üzerinde deney plaka (lar) çalkalayın. 32 ° C inkübatör dönmek. 4. günde, bir titre plaka karıştırıcısı üzerinde 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde deney plakasının (ler) çalkalayın. Bir plaka okuyucusu kullanılarak, daha sonra yaklaşık 1 saat için stand 540 nm'de (CPRG ~ 575 nm için en uygun emiş) ve (bulanıklık) 620 nm 'lik bir emişteki bir deney plakası (ler) okuma plaka (lar) bırakın. oda sıcaklığında plaka (lar) ve gerekirse daha sonra okumak bırakın. Östrojenik aktivite hesaplamaları <ol> aşağıdaki denklem kullanılarak bulanıklık için doğru tahlil okuma: Düzeltilmiş değeri = örnek veya 540 nm'de standart (E2) absorbans – [620 nm'de örnek veya standart (E2) absorbans – 620 nm'de boş absorbans]. Uygun boşlukları (kirlenme kontrol etmek için) ile arsa E2 standart eğri 8. 'Estradiol eşdeğerleri' hesaplamak için düzeltilmiş örnek (özü ya da kimyasal) kullanın. / Numuneyi katmak E2 eşdeğer değerlere absorbans değerleri ayıklamak için çizilen E2 standart eğri değerleri ve regresyon denklemini (3 parametreli polinom veya lineer fit bağlı olarak) kullanın. Kullanım konsantrasyon faktörü (yani, su ekstre edilmiş ve hacim etanol ekstresi içinde yeniden süspansiyon haline) Önceden ekstre numunede östrojenik aktivite hesaplamak için kullanılır. Erkek Etkafa golyan Vivo vitellogeninin İndüksiyon olarak kullanılması östrojenik Faaliyet 4. Laboratuvar Dayalı Değerlendirme (Pimephales erkek fathead minnows kullanınpromelas)> sekonder seks karakterleri (görüntüler eski 4 ay, yani gerdek tüberküllerin geliştirilmesi ve erkek cinsel belirlenmesi gösteren bir sırt fatpad). yumurtlama etkinliği önlemek için, ayrı olgun testi başlamadan önce üç hafta (± 3 gün) erkekler. 3 g / l arasında bir en fazla yükleme olan en az iki 45 L cam akvaryumları ayarlayın. test için sağlıklı balıkların yeterli sayıda sağlamak için, 100 erkek en az kullanın. Test deneyimli olacak gibi aynı çevre koşullarında erkek balık tutmak (yani, 25 ± 1 ° C su sıcaklığı ve 16: 8 saat aydınlık: karanlık fotoperiyot). Örneğin, en azından her 6-8 saat, bir% 95 değiştirme zamanı sağlamak için her bir tank için seyreltme suyu akış oranının muhafaza, 45 L tankı 330 ml / dakika. Test cihazı ve deneysel tasarım wat litresi başına balık en fazla 3 g yükleme karşılamak için büyük bir cam tankları kullanıner. 8 yetişkin erkekler (nominal 4.5 g her), 10-20 L tankı kullanın. Her tedavi için iki çoğaltma tankları kullanın ve gereksiz görme bozuklukları her tankı kalkan (yani, tanklar arasındaki lamine kart ekranlarını kullanın). Bir çalışmada numarası, bir poz konsantrasyonu ve bir gemi kimlik numarası ile her tankı tanımlayın. atıksu çıkış suyu çalışmaları için varışta, hemen 10 ± 1 ° C'de depolama tankına atık aktarın. atık alınmasından itibaren iki saat içinde atık dozaj başlayın. Aklimasyonundan kabına 10 ° C depolama tankından, peristaltik pompa vasıtasıyla, atık besleyin. 18 ± 2 ° C'de aklimasyonundan kabı içinde çıkış maddesinin ısıtın. (Balık tutan) testi akvaryumları sonra dozlama / karıştırma damarlarına aklimasyonundan kaptan ısıtılmış atık pompa ve. 25 ± 1 ° C 'lik bir sıcaklığa akvaryumları ısıtın. kimyasal dozlama çalışmaları için toz ağırlığındaki kabininde test kimyasalları tartılır. Tercih edilen çözücüler kullanılmadan GKD 2 O konsantre kimyasal stokları hazırlayın. Not: çözücüler test bileşiklerinin çözündürülmesi için gerekli olması halinde, seyreltme suyu kontrolüne ek olarak çözücü madde kontrolleri kullanın. karıştırma kabı dozlama için akış kontrol cihazı (ler) üzerinden bir sıcaklık kontrollü başlık tankı / Yerçekimi besleme veya pompa seyreltme suyu. Pompa gemileri karıştırma / doz bir peristaltik pompa sistemi kullanılarak kimyasal stok (ler) konsantre. İstenen poz konsantrasyonu elde etmek ve su debisi (seyreltme suyu) (stok kimyasal) pompa hızını kontrol edin. Not: Kullanım silikon tüp karıştırma kabı / dozajlama gelen her test kabına su / Test kimyasal beslemek için. En az 24 saat% 75 kabı değiştirilmesini sağlamak için yeterli olan bir akış oranı, 20 L'lik bir tank için, yani, 20 ml / dakika kullanın. belirtilen nominal değerin ±% 10 akış hızını korumak. </li> (25 ° C'de 5.8 mg L-1) 25 ± 1 ° C'de poz tankı su sıcaklığı, hava doygunluğu değerinin% 70 üzerinde çözünmüş oksijen ve çalışma boyunca (6.5 ila 8.5 pH değeri başlayarak) ± 0.5 pH birimi koruyun. 16 saat ışık photoperiod aydınlatma koşullarını ayarlayın: 8 saat karanlık, 20 dakika şafak / alacakaranlık geçiş dönemleri ile. Balık 2.5 (± 0.1) de taze çözüldü dondurulmuş yetişkin artemia (Artemia) ile günde iki kez yem başına tank başına g besleyin. Ayrıca tropikal pul balık yemi küçük bir miktar (iki parmak tutam) ile günde bir kez balık yemi. Her yem arasında 3 saat en az bırakın. (Kontrollere göre, iyi, orta veya kötü) beslenme tepkisi / davranışını izlemek için bir günlük beslenme kaydını tutun. herhangi meyvelerin gıda ve dışkı çıkarmak için en az iki kez (tercihen günde) bir hafta tankları sifon. En az haftada bir kez deney gemilerin kenarlarına ve dipleri temizleyin. Haftalık su örneği alınHer tanktan s (analitik kimya yoluyla) (Maya ekran üzerinden) östrojenik aktivite ve kimyasal kompozisyonunu onaylamak için. su örnekleme, özetleme ve analiz ayrıntıları için bölümlere 1-3 bakınız. Not: her bir deney için, doz yanıtını izlemek için seyreltme suyu kontrol (negatif kontrol), pozitif kontrol (E2 ve EE2) artı çıkış maddesi (100, 50 ve% 25), en az üç ya da test dilüsyonları kimyasal kullanımı. Yeni teknolojiler test ise, tedavi olan veya olmayan bileşik / çıkış maddesinin kullanımı (tedavisiz ör EE2, TAML / hidrojen peroksit ile EE2 (H2O 2) tedavisi 12; Şekil 1). TAML / peroksit su arıtma kullanarak 17α-etinilestradiol ekotoksisite kaldırılmasını belirlemek için bir in vivo fathead minnow vitellogeninin Biyoassay deneysel tasarımı temsil eden Şekil 1. Diyagramı. Ihrkurmak erimental sekiz 11 L cam akvaryumlara suyun sürekli akışı ile her beslenen oluşur. Bağımsız bir kimyasal stok çözeltileri ve su (süzüldü deklorine) karışım odası teslim edilir. Karıştırma damarlarda (reaksiyon olmadan) Nominal konsantrasyonları 2 ng / L EE2, 80 nM TAML ve 0.16 mg / LH 2 O 2 'dir. Kimyasal stok çözeltileri (EE2, H 2 O 2 ve TAML) hazırlanmış ve reaksiyonları karıştırma damarlarda başlaması, böylece ayrı ayrı dozlanmıştır. Balıklar (tank başına 8 erkek fathead balıklardır) yaklaşık 45 dakikalık bir reaksiyon süresinden sonra karışım (lar) maruz kalmaktadır. Su numuneleri haftalık maruziyet tankları alınır. Plazma örnekleri çalışmanın başında, bir temel grubundan östrojenik biyobelirtecin vitellogeninin (VTG) ölçmek için fathead minnows alınan ve maruz kalma 21 gün sonra tüm diğer balık vardır. Belirli tedaviler şunlardır: '-C'; Negatif kontrol (seyreltme suyu sadece), '+'; EE2 olumlu kontrolü,'+ H'; EE2 artı H 2 O 2 '+ T'; EE2 artı H 2 O 2 artı TAML. Bu rakam Mills ve ark., 2015 12 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Test prosedürü aklimasyonundan dönemi Her seksüel olgunluğa erişmiş erkek balık ıslak ağırlığı (g) ölçün ve her tankın (tank başına 8 erkek) rastgele ayrılamadı. Aynı partiden ayrılmamış balık tutmak ve aynı test koşullarında onları korumak. fiziksel hasar ya da 7 günlük alıştırma döneminde durumun eksikliği belirtileri göstermeye herhangi bir bireyi değiştirmek için bu balıkları kullanın. Her tedavi tankı tamamen test koşullarına acclimated olan 8 erkek vardır aklimasyonundan döneminin sonunda olun. Aynı ba ek bir 8 erkeklerden 'temel' plazma numuneleri almakerkek balık tch. bölüm 4.4 kan örnekleme yöntemi ve 4.5 de vitellogeninin (VTG) analiz yöntemini izleyin. 4.2.2 ya 4.2.3 de tarif edildiği gibi bir alışma periyodunun ardından 21 gün süreyle maruz tanklarına çıkış maddesi ya da kimyasal dozaj stokları sağlar. Monitör ölüm, davranış ve her balık fiziksel görünümü günün ilk yem günlük öncesinde tankı çoğaltırlar. Herhangi bir anormal davranış veya olayları kaydetmek. Not: çevresel koşulların sağlanması ve beslenme oranları balıkların sağlığını (bölümler 4.2.4 ve 4.2.5) korumak. 21 günlük maruziyet süresinden sonra balık Örnekleme örnekleme öncesinde 12 saat, balık besleme durdurmak. Kan örneklerinin toplanması için etiket mikro santrifüj tüpleri, Aprotininin ~ 5 ul (bir proteaz inhibitörü) ekleyin ve buz üzerine koyun. deklorine 1 L su başına MS222, 500 mg çözülmesiyle MS222 (anestezi) içindeki bir 500 mg / l'lik bir çözelti (daha önce iklime25 ± 1 ° C). 1 M NaOH ile pH 7.4 ± 0.4 MS222 nötralize. tamponlu MS222 halinde depodan her balık getirin. Tüm operkulum hareketi (genellikle 5 ± 1 dakika) sona erene kadar çözelti içinde tutun. Tedbir ve terminal anestezi altında çatal uzunluğu (mm) kaydedin. Kuyruk kesmek ve kaudal arter (Şekil 2) kan toplamak için heparinli hemocrit tüp kullanmak için tek kullanımlık neşter kullanın. Dikkatle önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpe kan dağıtmak ve buz üzerinde tutmak. Kan çizdikten sonra hemen balıkları öldür. dolaşım ve / veya beyin imha kalıcı durmasıyla ölüm onaylayın. Tedbir ve toplam balık ağırlığı (en yakın 0.01 g) kaydetmek ve gerektiğinde dokuların teşrih. toplama, 2 saat içinde kan (4 ° C'de 5 dakika boyunca 7,000 x g) santrifüjlenir. Yeni etiketli 0.4 ml mikrosantrifüj küvetin içine bir pipet kullanarak plazma süpernatant aktarınbuz üzerinde es ve mağaza. Plazma VTG konsantrasyonlarının analiz edilmeden önce -80 ° C 'de santrifüj ve mağaza 30 dakika içinde, kuru buz üzerinde plazma içeren tüpler dondurun. Şekil erkek (Pimephales promelas), plazma toplama ve testis yerini gösteren 2. Fotoğraf. Bütün balık kan örnekleri toplamak için öldürülmeleri gerektiğini 21 günlük maruziyet sonunda. Bir kez hızlı bir şekilde, ölçülen kaudal arterden kan toplama takip gerekir bu terminal anestezi balık uzunluğu (çatal boy, mm) altında Photo-A:. ​​Kırmızı noktalı çizgi (tek kullanımlık neşter kuyruğu kesmek için kullanılması gereken kuyruk amputasyon için yeri gösterir ). Fotoğraf-B kan toplamak için kullanılan bir heparinli hemocrit tüpü gösterir. onun kan örneği alındıktan sonra her balık bu durumda bütün kafa içinde, hemen öldürülmesi gerektiğinivücut (Foto-C) den kopmuş edilmiştir. Balık öldürüldü edildikten sonra vücut boşluğuna iç organları ortaya kadar açılabilir. Fotoğraf-C vs sazan balıkları, örneğin, fathead minnow, kızılkanat, sazan, yüzmek mesane (SB) göre testis (gonad) konumunu gösterir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. fathead minnows için özel olarak tasarlanmış bir homolog VTG enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti ile, plazma VTG konsantrasyonları ölçülür. üreticinin protokolü tarif edilen VTG standartları ve tamponlar hazırlamak. 5,000 ve 1: plazma örneği 01:50, 1 seyreltilir 500.000 ve üreticinin talimatlarına göre VTG standart eğri aralığında okumaları elde etmek için iki nüsha halinde bunları tahlil. vitellogeninin konsantrasyonlarını hesaplamak için üreticinin yönergeleri izleyin. </li> Gelişmiş / Roman Atıksu Arıtma Teknolojileri 5. Tarla Değerlendirmeleri Roach Vivo vitellogeninin ve İnterseks İndüksiyonunun (Rutilus rutilus) olarak kullanılması östrojenik aktivite Azaltmak için yabani roach yakalama Atıksu Arıtma Tesisi deşarjı akışı aşağı yaşayan Not: gonochoristic ve östrojenik endokrin bozulmasına duyarlı olduğu bilinen vardır kullanın roach (Rutilus rutilus) ya da diğer bol tatlı su veya tuzlu balık türleri. Balık yakalamak, electrofishing kullanarak örgü, yakalama ya da durumun 13 bağlı diğer tanınmış balıkçılık yöntemleri. Örnekleme için laboratuvara geri havalandırılan tanklarda balık taşıyın. 4.4.2 detaylı olarak mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. 4.4.3 tarif edildiği gibi MS222 tamponlu hazırlayın. 4.4.4 detaylı olarak balık uyutmak. Terminal anestezi altında balık boy ve ağırlık ölçün. kaudal arter kullanarak Dispo kan toplamaksamur heparinize şırınga. hemen kan örneği alındıktan sonra her balık öldür. Dikkatle önceden etiketli mikrosantrifüj tüpler içine kan dağıtmak ve buz üzerinde tutmak. Adım 4.4.7 de açıklandığı gibi plazma hazırlayın ve ELISA (4.5) ile VTG ölçün. forseps her balığın 2-3 balık pulları kaldırmak ve tek tek etiketli küçük kağıt zarf yerleştirmek kullanma. Daha sonra balık yaş tayini ve büyüme analizi için kuru koşullarda oda sıcaklığında saklayınız zarflar. Bir neşter ile Açık vücut boşluğuna iç organları ortaya çıkarmak için. Iki tarafında yer alan bir gonad (Şekil 2) ile yüzmek mesane ortaya çıkarmak için bağırsak dışarı atın. Dikkatle cam şişenin içine ince burunlu forseps ve yer ile eşleştirilmiş gonadlar çıkarın. 01:10 doku oranında Bouin fiksatifi sahip gonadlar için kullanılabilir: sabitleştirici. doku büyüklüğüne (sabitleştirici saat başına 1 mm nüfuz) bağlı olarak 6-24 saat süreyle Bouin en doku bırakın. Sabit sonra Bouin sabitleştirici bir off dökün% 70, endüstriyel metil alkol (IMS) ile değiştirin d. dokular histopatolojik (Bölüm 5.3) için işleme kadar oda sıcaklığında sabit doku saklayın. Roach in vivo vitellogeninin ve interseks indüksiyon kullanarak östrojenik aktivite Alan dayalı değerlendirme Deney tasarımı ve kurmak Not: in vivo çalışma başlatılmasının öncesinde de tank ve pilot tesisi kurma. sisteme balık herhangi ilave edilmeden önce 3-4 hafta akan tankları başlayın. Su akış oranları, su kalitesi ve emin parametreleri aktif hale getirmek için düzenli olarak şartları (pH, sıcaklık, çözünmüş oksijen, vb) Monitör korunabilir. Büyük tanklar Construct (örneğin, 300-1,000 L) 'kontrol' alabilir pilot tesis sitesinde, klorlu de musluk suyu, standart tedavi atık (lar) ve paralel tedavi atık (ler) gelişmiş. tanklara hava pompası / havalandırıcılar takın. Set su akış hızları en az 6 tankı v ulaşmak içinGünde olume değişim. Not: tanklar iyi yalıtılmış ve aşırı günlük sıcaklık dalgalanmaları önlemek için gölgeli olduğundan emin olun. Tasarım tankları davranışsal değişiklikler (beslenme yetersizliği vb), hastalık ve ölüm belirtileri için balık gözlem, izin vermek. 1 saat için ilgili tanklarda (balık çiftliğinden) roach çanta yüzen pozlamayı başlayın. yavaş yavaş su sıcaklığına kadar çanta tank su ekleyin ve koşullar, ortam vardır. onların tankları içine balık bırakın. pelet haline balık yemek (boyut 0.5-0.8) günlük yetişkin roach besleyin. Uneaten yem temelinde ayarlanmış küçük topak haline (pelet boyutları 100-300) non-östrojenik besleme 14 ad libitum, günlük çocuk roach besleyin. Bir günlük besleme rekor belgeleyen besleme yanıtı / davranış tutmak (kontrollere kıyasla, orta veya zayıf, iyi). östrojenik aktivite ve kimyasal kompozisyonunu onaylamak için her tanktan haftalık su numuneleri alır. Sesu numune alma ve analiz yöntemleri ile ilgili ayrıntılar için e bölümleri 1-3. Balık histopatoloji 15 Gonadlar Dikkatle bir kesme tahtası üzerinde cımbız ve yer ile kaptan (adım 5.1.6 ve 5.1.7 açıklanmıştır) disseke ve sabit gonadlar çıkarın. 3 bölümden (ön, orta ve arka) içine ve her bölüm 3-5 mm kalınlığında kesiti kesim her gonad kesmek için bir mikrotom bıçak kullanın. Dikkatle etiketli plastik biyopsi kaset içine altı adet koyun ve Tablo 4'te listelenen zamanlamaları kullanılarak doku işlemci içine yerleştirin. Balmumu embed dokular ve döner mikrotom (3-5 mikron) bölüm. (45 ° C'de ayarlanır) ısıtılmış bir plaka üzerinde etiketli biyo-yapışkan kaplı cam slaytlar ve yer slaytlar transfer bölümleri 24 saat boyunca kurumaya. . Ya elle ya da Tablo 5'te ayrıntılı zamanlamaları kullanarak, otomatik Stainer kullanarak, slaytlar Leke lekeli doku üzerinde montaj maddesinin bir damla yerleştirin ve lay cam doku korumak için montaj ajan üzerinde lamel. İlk olarak, cinsiyet belirleme (10X göz hatları büyütme ile 20X, yani 2X objektif) düşük büyütme her slayt ve vücut boşluğuna 15 eklerin noktalarının sayısını inceleyin. Her balık için herhangi bir anormallik edin. Daha yüksek büyütme (100X veya 400X) at, gametogenez aşamaları, anormallikler ve testis dokusunda oosit varlığını değerlendirmek için doku incelemek. 6 (Tablo 6) 7 (% 100 yumurtalık dokusu) 0'dan değişen aşağıdaki derecelendirme sistemi (normal erkek doku) kullanarak interseks şiddetini kaydedin. adım sayısı tedavi amaç Süresi (saat) 1 % 70 IMS kurutma 3 2 % 90 IMS kurutma 2.5 3 % 95 IMS kurutma 1.5 4 % 100 IMS kurutma 1.5 5 % 100 IMS kurutma 1.5 6 % 100 IMS kurutma 1.5 7 % 100 IMS kurutma 1.5 8 Histoloji temizleme maddesi takas 1.5 9 Histoloji temizleme maddesi takas 1.5 10 Histoloji temizleme maddesi takas 1.5 11 BALMUMU Wax infiltrasyonu 1.25 12 BALMUMU Wax infiltrasyonu 1.25 20 saat TOPLAM Tablo 4. İşleme histopatoloji için doku emprenye balmumu rejim. Dokular otomatik doku işlemcisinde işleme tabi tutulmalıdır. Dokular belirtilen süre için ayrıntılı çözümleri dalmış olmalıdır. Hayır Leke. Leke amaç Süresi (dak) 1 Histoloji Takas ajan balmumu erir 15 2 <td>% 100 IMS hidrasyon 2 3 % 90 IMS hidrasyon 2 4 % 70 IMS hidrasyon 2 5 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) Durulama 2 6 hemotoksilin Lekeleri hücre çekirdekleri mavi 10 7 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) fazla kaldır 10 8 asitleştirilir IMS klorsuzlaştırma 20 sn 9 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) Durulama 20 sn 10 LICO 3 Tuz 20 sn 11 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) Durulama 20 sn 12 % 1 Eosin (sulu) Lekeleri sitoplazma pembe 20 sn 13 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) fazla kaldır 5 14 % 70 IMS kurutma 2 15 % 90 IMS kurutma 2 16 % 100 IMS kurutma 5 17 Histoloji Takas ajan IMS, bağlama maddesini çıkarın 5 Tablo 5. Hematoksilen ve Eosin (H & E) Balık gonadal dokuların boyanması için çözümler ve daldırma süreleri. Slaytlar Alloc her banyosunda yerleştirilmelidirsırayla zaman caktır. Dokuların H & E boyama balık gonadlar üzerinde östrojenik atıksu atık gelişimsel ya da örgütsel etkilerini belirlemek için gereklidir. Gol bölüm Açıklama 0 Normal erkek testis 1 Multifokal testis dokusunda arasında dağılmış 1-5 oosit (genellikle tek başına) ile ovotestis 2 Multifokal ovotestis, genellikle küçük kümeler halinde 6-20 oosit testis dokusunda arasında dağılmış 3 Multifokal ovotestis, kümeler halinde 21-50 oosit 4 > 50 ve <100 oosit. Bölüm genellikle multifokal ve test bir mozaik görünümündediricular ve yumurtalık dokusu. 5 > 100 oosit, genellikle multifokal ama aynı zamanda testis dokusundan ayrılır yumurtalık ve testis dokusunun açıkça tanımlanabilir bölgeleri ile fokal olabilir. 6 bölümündeki gonadal doku yüzde> 50 yumurtalık ve açıkça epitel hücreleri ve fagositik dokuların testis dokudan ayrılır. 7 bölümünde gonadal doku 100 yüzde yumurtalık olduğunu. Tablo 6. skorlama sistemi roach interseks durumunun ciddiyetini değerlendirmek için. Histolojik gonad dokusu hazırlanan slaytlar ışık mikroskobu altında incelenmesi gerektiğini, 20X de, 100X ve 400X büyütme, herhangi bir anormallik ve testis dokusunda oosit varlığını değerlendirmek için. Bu tablo Jobling <modifiye edilirem> ve diğ. 2006 6.