Utilizzo di una batteria di chimici ed ecotossicologici metodi per la valutazione dell'efficacia dei processi di trattamento delle acque reflue per rimuovere estrogenica Potenza

dichiarazione etica: Protocolli per valutare l'attività di distruttori endocrini delle sostanze chimiche / miscele nei pesci sono stati approvati dal benessere degli animali di Brunel University di Londra e etico Review Body (AWERB) e dal Regno Unito Home Office sotto gli animali (Procedure Scientifiche) Act 1986. 1. Acqua Campione raccolta, conservazione ed estrazione la raccolta e la conservazione del campione Prima dell'uso, pulire le bottiglie con un detergente tensioattivo adatto. Dopo la pulizia, sciacquare le bottiglie con acqua, scarico e asciutto. Raccogliere campioni in bottiglie di vetro di capacità 2-L contenente conservante costituito da 0,5 g di rame (II) e nitrato di 6 ml di soluzione di acido cloridrico 3,6 M. Conservare i campioni inferiori a 10 ° C. Estrarre e analizzare il più presto possibile dopo la raccolta e la conservazione. Estrazione del campione e clean-up (per l'analisi estrogeni steroidi) 10 Estrazione in fase solida (SPE) Prima di estrazione, per ridurre solidi sospesi, campioni di acqua filtro utilizzando carta da filtro dimensione dei pori 1 micron. Una volta filtrato, campioni picco con standard interno con l'aggiunta di 100 ml di chiodare deuterato soluzione madre standard interna contenente 2,4,16,16-D 4 -estrone: 2,4,16,16-D 4 -17β-estradiolo (E2) : e 2,4,16,16-d 4 -17α-etinilestradiolo (EE2) (tutti a 40 mg / L in metanolo) a 1.000 ml di effluente (o 100 ml influente) con conseguente picco interna di 2 ng / L per acque di scarico campioni di effluenti, e 20 ng / L per i campioni influenti delle acque reflue. Fissare le fodere monouso valvole, cartucce SPE stirene divinilbenzene, e serbatoi cartuccia all'apparato SPE. Inserire la pompa del vuoto per testare l'apparecchiatura è adeguatamente sigillato. Pipettare 5 ml di acetato di etile in ciascun serbatoio, per il condizionamento delle cartucce. Accendere la pompa del vuoto (al di sotto di 10 inHg per consentire una portata inferiore a 10 ml al minuto)e tirare attraverso il liquido. Non lasciate che le cartucce SPE seccano. Ripetere con 5 ml di metanolo seguiti da 5 ml di acqua. Riempire ogni serbatoio della cartuccia con acqua e collegare tubi PTFE 1/8 "tra i bacini cartuccia e bottiglie di campionamento di vetro. Accendere il vuoto con una portata inferiore a 10 ml al minuto e consentire l'intero campione di passare attraverso la cartuccia. svuotare il pallone rifiuti, se necessario. Asciugare accuratamente le cartucce SPE sotto vuoto (o utilizzando aria o azoto) fino a quando il contenuto delle cartucce cambiare colore (ad esempio, dal marrone scuro al marrone chiaro). Mettere puliti a secco 10 ml fiale di vetro di raccolta in rack e posto all'interno del collettore di estrazione. Controllare che ogni nave è al di sopra di un flaconcino. Pipettare 8 ml di diclorometano in ciascun serbatoio campione, accendere la pompa del vuoto (portata inferiore a 10 ml al minuto) e tirare il liquido attraverso nelle fiale di raccolta. Rimuovere 10 ml fiale dal collettore SPEe utilizzare un concentratore di ridurre il volume di 1 ml. Trasferire ciascun campione nella fiala di auto-campionatore e l'ulteriore concentrarsi per 100 ml utilizzando blow down attrezzature di azoto. Permeazione di gel cromatografia (GPC) clean-up Iniettare 95 ml di estratto del campione eluito in HPLC equipaggiato GPC utilizzando le condizioni descritte nella tabella 1. Concentrato GPC estrarre fino a 200 microlitri utilizzando un concentratore e azoto soffiano verso il basso apparato e poi fare fino a 2,0 ml con esano. SPE clean-up Fissare le fodere monouso valvole, cartucce amminopropil, e serbatoi cartuccia al collettore SPE. Mettere puliti a secco 10 ml fiale di vetro di raccolta in rack e posto all'interno del collettore di estrazione. Pipettare 2 ml di esano in ciascun serbatoio, per il condizionamento delle cartucce. Lasciare il liquido di passare attraverso le cartucce. Pipettare il campione estratto GPC nel serbatoio e ancora consentire al liquido dipassare attraverso la cartuccia. Raccogliere l'eluato campione nella fiala e rimuovere dal collettore. Non gettare eluato. Mettere una nuova secca flaconcino da 10 ml di raccolta pulita in rack e posizionare all'interno del collettore di estrazione. Per lavare la cartuccia, aggiungere 2 ml di acetato di etile in esano (30% v / v) al serbatoio e tirare il liquido attraverso la cartuccia. Ripetere con altri 2 ml di acetato di etile in esano, scartando tutti lavaggi. Posizionare i 10 ml di raccolta flacone originale (passo 1.2.3.2) indietro nel cremagliera all'interno del collettore di estrazione. Pipettare 2 ml di etile acetato in acetone (50% v / v) nel serbatoio, accendere la pompa del vuoto (al di sotto di 2 inHg per consentire una portata inferiore a 2 ml al minuto) e tirare il liquido attraverso nel flaconcino . Ripetere il processo con altri 2 ml di etile acetato. Rimuovere la fiala campione e utilizzare un concentratore per ridurre il volume estratto per 1 ml. Trasferire il campione in una fiala di vetro minore e utilizzando azoto spurgo attrezzature, evaporare tha estratto a secchezza incipiente. Aggiungere 100 ml di metanolo e mescolare bene. Trasferire l'estratto ad un autocampionatore flaconcino (0,3 ml inserto) e tappare la fiala. Analizzare i campioni utilizzando LCMS / MS (vedere la sezione 2). Colonna: PL gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 micron Guardia Colonna: PL gel, 50 x 7,5 mm, 5 micron Fase mobile: diclorometano Portata: 1 ml per minuto Temperatura della colonna: 25 ° C Rivelatore UV: 210 nm Volume di iniezione: 95 ml Modalità di iniezione: stare in piediARD Draw Velocità: 500 ml al minuto Espulsione Velocità: 500 ml al minuto Posizione Draw: 3 mm Frazione raccolte: 3 ml frazione (7 – 10 min) in 10 ml flaconcini Tabella 1. Condizioni e parametri per la permeazione di gel cromatografia (GPC) clean-up di campioni di acque reflue estratti. Tabella dei dettagli della colonna GPC, fase mobile, la temperatura, il volume di iniezione, e rilevatore di lunghezza d'onda. Estrazione del campione (per lo schermo di lievito estrogeni) Filtrare i campioni come indicato nella sezione 1.2.1.1. Fissare le fodere monouso valvole, cartucce C18 SPE, e serbatoi cartuccia all'apparato SPE. Accendere la pompa a vuoto per testare l'apparecchiatura è adeguatamente sigillato. Pipettare 5 ml di metanolo in ciascun serbatoio, per condizionare la C18 cartucce. Attivare vuoto (a circa 5 inHg per consentire un flusso di circa 5 ml al minuto) e far funzionare il liquido attraverso, facendo una pausa per 1 min a metà. Non lasciate che le cartucce di funzionare a secco. Ripetere sia con grado HPLC o acqua bidistillata (DDH 2 O). Anche in questo caso non funzionare a secco. Estrarre campioni di acqua come descritto nella sezione 1.2.1.4. Continuare il vuoto per almeno 30 minuti per asciugare le cartucce. Luogo asciutto e pulito fiale di raccolta 10 ml in un rack nel collettore di aspirazione. Controllare che ogni nave è al di sopra di un flaconcino. Aggiungere 5 ml di metanolo per ciascun serbatoio. Accendere il vuoto (flusso massimo di 5 ml / min) e permettere al liquido di passare attraverso la cartuccia nel flaconcino, fermandosi per 2 min a metà. Prima di analisi utilizzando la schermata YES, ridurre l'estratto a secchezza incipiente con azoto e ricostituire con 500-1000 ml di etanolo. Sigillare i coperchi di fiale campione per evitare l'evaporazione e conservare a 4 ° C (in un free-scintillafrigo). 2. Analisi chimica utilizzando LCMS / MS Ottimizzare le condizioni di funzionamento del sistema LCMS / MS utilizzando le istruzioni del produttore. Analizzare soluzioni standard di taratura, gli estratti dei campioni, campioni di controllo in bianco e analitica della qualità (AQC) utilizzando la cromatografia liquida e le condizioni di spettrometria di massa, e monitorare le transizioni di ioni come indicato nella tabella 2. Determinare la concentrazione di estrogeni steroidi nell'estratto del campione utilizzando interna norme 10. LCMS Cromatografia liquida Colonna: C18 (2), 150 x 4.6 mm 5 micron. Volume di iniezione: 20 microlitri Flusso: 0,5 ml al minuto. MFase Obile: Solvente A: acqua contenente 0,1% di ammoniaca. Solvente B: acetonitrile. programma di Gradiente: Tempo (min) 0 10 18 24 28 A: B rapporto di solvente 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00 Spettrometria di massa Fonte: Elettrospray (ioni negativi) Gas e la fonte: CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi TEM: 600 ° C, gas CAD 5 e IonSpray tensione -900 transizioni MRM: </td> E1: 269/145 e 269/143 E2: 271/145 e 271/143 EE2: 295/145 e 295/143 E1-D4: 273/147 E2-D4: 275/147 EE2-D4: 299/145 Tabella 2. Dettagli parametri e le condizioni per l'analisi LCMS / MS di estrogeni steroidi in estratti delle acque reflue. Tabella dona volume di iniezione del campione e la portata, le condizioni di fase mobile AND gradiente. 3. estrogenica Attività Usando in vitro schermo lievito estrogeni (SI) Assay 8 Preparare e memorizzare i componenti medie e medio minimo come da Tabella 3 (a) a (g). (a) terreno minimo (pH 7.1): Preparare una Fe 2 (SO 4) 3 soluzione aggiungendo 40 mg di Fe 2 (SO 4) 3 a 50 ml di acqua bidistillata (DDH 2 O) Aggiungere 1 L DDH 2 O per un bicchiere di vetro 2 L Aggiungere i seguenti componenti al bicchiere: 13.61 g KH 2 PO 4 1.98 g (NH 4) 2 SO 4 4,2 g KOH 0,2 g MgSO 4 1 ml di Fe 2 (SO 4) <sub> 3 soluzione 50 mg L-leucina 50 mg di L-istidina 50 mg adenina 20 mg di L-arginina-HCl 20 mg di L-metionina 30 mg L-tirosina 30 mg di L-isoleucina 30 mg di L-lisina-HCl 25 mg di L-fenilalanina acid 100 mg L-glutammico 150 mg di L-valina 375 mg di L-serina Mettere il bicchiere sul agitatore riscaldata con una pulce magnetica e mescolare fino a quando tutto è sciolto Verificare che il pH è 7.1 e regolare, se necessario, Utilizzando un 50 ml siringa sterile erogare 45 ml aliquote in bottiglie di vetro con vite di metallo top coperchi Sterilizzare il terreno minimo a 121 ° C per 10 minuti in autoclave Conservare a temperatura ambiente (b) D – (+) – Glucosio: Preparare un 20% w / v in DDH 2 O Dispensare 20 ml aliquote a fiale di vetro con coperchi a vite in metallo top Sterilizzare la soluzione di glucosio a 121 ° C per 10 minuti in autoclave Conservare a temperatura ambiente (c) L-aspartico Acido: Ottenere una soluzione stock di 4 mg / ml in DDH 2 O Dispensare 20 ml aliquote a fiale di vetro con coperchi a vite in metallo top Sterilizzare la soluzione L-aspartico a 121 ° C per 10 minuti in autoclave Conservare a temperatura ambiente (d) Vitamina Soluzione: Preparare una soluzione di biotina aggiungendo 2 mg di biotina a 100 ml di DDH 2 O Pesare 8 mg di tiamina, 8 mg di piridossina, 8 mg di acido pantotenico, inositolo 40 mg. Aggiungere tutti i componenti secchi e 20 ml della soluzione di biotina a 180 ml ​​DDH 2 O Rendere 10 ml aliquote sterili filtrando attraverso un 0,2 micron dimensione dei pori del filtro monouso in bottiglie di vetro sterili, in una cappa a flusso laminare Conservare a 4 ° C (e) L-Treonina: Preparare 100 ml di 24 mg / ml di L-treonina in DDH 2 O Dispensare 10 ml aliquote a fiale di vetro con coperchi a vite in metallo top Sterilizzare la soluzione L-treonina a 121 ° C per 10 minuti in autoclave Conservare a temperatura ambiente <strong> (f), rame (II) Solfato: Preparare 25 ml di (II) solfato soluzione 20 mM di rame in DDH 2 O Effettuare 5 ml aliquote sterili filtrando attraverso un 0,2 micron filtro dimensione dei pori in bottiglie di vetro sterili, in una cappa a flusso laminare Conservare a temperatura ambiente (g) di rosso di clorofenolo-β-D-galactopyranoside (CPRG): Preparare 25 ml di una soluzione 10 mg / ml di CPRG in DDH 2 O Effettuare 5 ml aliquote sterili filtrando attraverso un 0,2 micron filtro dimensione dei pori in bottiglie di vetro sterili, in una cappa a flusso laminare Conservare a 4 ° C Tabella 3. Lievito dosaggio di estrogeni schermo; preparazione e conservazione dei minimi componenti medie e medio. Preparazione e storage di 10x coltura di lievito concentrato Il giorno 1, preparazione terreno di crescita (come dettagliato nella 3.4.1) e versare in una beuta sterile. Aggiungere 125 ml di 10x lievito concentrato dalla fiala criogenico conservati a -20 ° C. Incubare i media inoculato a 28 ° C per circa 24 ore su un agitatore orbitale. Il giorno 2, fare due bottiglie di mezzo di crescita (~ 50 ml) e versare in beute sterili separati. Aggiungere 1 ml di 24 ore di lievito coltivato in ogni bottiglia di terreni di crescita. Incubare i media inoculato a 28 ° C per circa 24 ore su un agitatore orbitale. Il giorno 3, versare ogni cultura di 24 ore in una provetta sterile da centrifuga da 50 ml. Centrifugare le provette da 50 ml a 4 ° C per 10 min a 2000 x g. Eliminare il sopranatante e risospendere ogni pellet in 5 ml di terreno minimo con il 15% glicerolo. Fare 0,5 ml aliquote della coltura di lievito concentrato 10x in 1,2 ml cryovials sterile e conservare a -20 ° C per un massimo di 4 mesi. Preparazione e di stoccaggio delle scorte chimici per curve standard Risciacquati e spatole due volte con etanolo assoluto e lasciare asciugare prima dell'uso per rimuovere eventuali tracce di contaminanti. Pesare E2 direttamente in una fiala di vetro in un armadio di pesatura polveri e regolare la concentrazione in volume in etanolo assoluto. Diluire a una concentrazione di 2×10 -7 M (54.48 mg / L). Guarnizione del coperchio e conservare a 4 ° C (in un frigorifero senza scintille). produttore Assay Il giorno 0, preparare il terreno di coltura. Per il flacone 45 ml di terreno minimo aggiungere 5 ml di soluzione di glucosio, soluzione di 1,25 ml di acido L-aspartico, 0,5 ml di soluzione di vitamina, 0,4 ml di soluzione di L-treonina, e 125 microlitri di rame (II) solfato soluzione. Versare mezzo di crescita in una beuta sterile. Aggiungere 125 ml di 10x magazzino concentrato (scongelato dallo stoccaggio -20 ° C) al pallone e incubare i media inoculate a 28 ° C per circa 24 ore su un agitatore orbitale. Il giorno 1, etichettare un 96 pozzetti 'piastra di diluizione' sterile e fare diluizioni seriali (100 volumi microlitri di etanolo) di E2 curva standard e test chimico (s) / estratto di effluente (s) (ad esempio, EE2). Etichetta sterile da 96 pozzetti otticamente piatta 'piastra di dosaggio (s)' fondo microtitolazione. Su ogni piastra di comprendere spazi (più / meno solvente) e una curva standard E2, oltre alle righe di sostanza chimica (s) / estratto di effluente (s). Pipettare 10 ml di ciascuna concentrazione (E2, chimici o estratto) nella ben appropriata della piastra saggio. Pipettare 10 ml di etanolo in ogni pozzetto 'solvente in bianco' della piastra saggio. Lascia piatto saggio con il coperchio per far evaporare a secchezza. Effettuare una bottiglia di mezzo di crescita (~ 50 ml) e aggiungere red-β-D-galattopiranoside soluzione 0,5 ml di clorofenolo (CPRG) per bottiglia. Determinare la densità delle cellule di lievito nella coltura di 24 ore misurando la torbidità della coltura a 620 nm in un lettore di piastre. Inoculare il unmedia ssay con 4×10 cellule di lievito 7 dalla cultura 24 ore. Versare terreno di coltura inoculato in un trogolo sterile. Usando una pipetta multicanale aggiungere 200 ml di terreno di coltura inoculato in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti test. Mettere il coperchio sulla piastra di dosaggio 96 e sigillare i bordi con nastro adesivo. Agitare la piastra di dosaggio (s) vigorosamente per 2 minuti su un agitatore titolo e incubare a 32 ° C in un armadio riscaldante ventilazione naturale. Il giorno 2, agitare la piastra test (s) con forza su un agitatore titolo per 2 minuti. Ritorno a 32 ° C incubatore. Il giorno 4, agitare la piastra test (s) energicamente per 2 minuti su un agitatore titolo. Lasciare la piastra (s) riposare per circa 1 ora quindi leggere la piastra di test (s) in assorbanza a 540 nm (assorbanza ottimale per CPRG ~ 575 nm) e 620 nm (per torbidità) utilizzando un lettore di piastre. Dare piastra (s) a temperatura ambiente e leggere in seguito, se necessario. calcoli attività estrogenica <ol> letture corrette analisi per torbidità utilizzando la seguente equazione: corretto value = campione o standard (E2) assorbanza a 540 nm – [campione o standard assorbanza (E2) a 620 nm – assorbanza del bianco a 620 nm]. Trama E2 curva standard con spazi adeguati (per verificare la presenza di contaminazione) 8. Utilizzare l'esempio corretto (estratto o chimica) per calcolare 'equivalenti Estradiolo. Utilizzare i valori tracciati E2 curva standard e equazione di regressione (3-parametro polinomiale o lineare a seconda della forma) per interpolare il campione / estrarre i valori di assorbanza a valori equivalenti E2. Uso fattore di concentrazione (cioè, acqua estratta e il volume di etanolo dell'estratto viene risospeso in) per calcolare attività estrogenica del campione pre-estratto. 4. Valutazione Laboratorio Based di estrogenica attività Utilizzando In Vivo vitellogenina induzione a Malè Fathead Minnows Utilizzare pesciolini Fathead maschi (Pimephalespromelas)> 4 mesi di età, che mostrano caratteri sessuali secondari (ad esempio, lo sviluppo di tubercoli nuziali e un fatpad dorsale) indicativo della determinazione sessuale maschile. Per evitare che l'attività di deposizione delle uova, separato matura Maschi tre settimane (± 3 giorni) prima dell'inizio del test. Impostare almeno due acquari di vetro 45 L con un carico massimo di 3 g / L. Per garantire un numero sufficiente di pesci sani per la prova, usare un minimo di 100 maschi. Mantenere il pesce maschio in identiche condizioni ambientali, come sarà sperimentato nel test (cioè, la temperatura dell'acqua di 25 ± 1 ° C e 16: luce 8 ore: fotoperiodo scuro). Mantenere la portata dell'acqua di diluizione per ogni serbatoio per assicurare un tempo di sostituzione 95% di almeno ogni 6 a 8 ore, cioè 330 ml / min per un serbatoio 45 L. Apparecchiatura di prova e disegno sperimentale Utilizzare contenitori in vetro di grandi dimensioni per ospitare un carico di fino a 3 g di pesce per litro di watER. Per 8 maschi adulti (nominalmente 4,5 g ciascuno), utilizzare un serbatoio di 10-20 L. Utilizzare due serbatoi di repliche per ogni trattamento e lo scudo ciascun serbatoio da eventuali disturbi visivi superflui (ad esempio, utilizzare schermi carta plastificata tra i serbatoi). Identificare ogni serbatoio con un numero di studio, una concentrazione di esposizione e di un numero di identificazione della nave. Per gli studi di acque di scarico degli effluenti Al suo arrivo, trasferire immediatamente effluente in un serbatoio di stoccaggio a 10 ± 1 ° C. Inizia dosaggio effluenti entro due ore dal ricevimento del refluo. Feed dell'effluente, tramite pompa peristaltica, dal serbatoio di accumulo C 10 ° ad una nave acclimatazione. Scaldare l'effluente nel recipiente di acclimatazione di 18 ± 2 ° C. Pompa l'effluente riscaldato dal recipiente acclimatazione alle dosaggio / vasi di miscelazione e quindi alla acquari prova (che detiene il pesce). Riscaldare acquari ad una temperatura di 25 ± 1 ° C. Per gli studi di dosaggio chimico Pesare le sostanze chimiche di prova in un armadio di polvere di pesatura. Preparare le scorte chimiche concentrate in DDH 2 O preferibilmente senza l'uso di solventi. Nota: Se i solventi sono necessarie per solubilizzare composti in esame, utilizzare controlli con solvente in aggiunta al controllo dell'acqua di diluizione. A gravità o acqua di diluizione pompa da un serbatoio a temperatura controllata con dispositivo di controllo del flusso (s) di dosaggio / recipiente di miscelazione. Pompa concentrato chimico stock (s) utilizzando un sistema di pompaggio peristaltico al dosaggio / vasi di miscelazione. Controllare la velocità della pompa (disponibile chimica) e portata d'acqua (acqua di diluizione) per raggiungere la concentrazione di esposizione desiderato. Nota: utilizzare tubo in silicone per alimentare acqua / test chimico per ciascun recipiente di prova dal dosaggio / recipiente di miscelazione. Utilizzare una portata che è sufficiente a fornire un sostituto recipiente 75% in almeno 24 ore, cioè 20 ml / min per un serbatoio 20 L. Mantenere la portata al ± 10% del valore nominale specificato. </li> Mantenere la temperatura esposizione all'acqua del serbatoio a 25 ± 1 ° C, ossigeno disciolto superiore al 70% del valore di saturazione dell'aria (5.8 mg L -1 a 25 ° C) e ± 0,5 unità di pH (a partire pH tra 6,5 e 8,5) in tutto lo studio. Impostare le condizioni di luce al fotoperiodo di luce 16 ore: 8 ore scuro, con periodi di transizione / crepuscolo all'alba di 20 min. Nutrire il pesce due volte al giorno con appena scongelati adulto congelato artemia (Artemia) a 2,5 (± 0,1) g per serbatoio per caduta. alimentare Anche il pesce una volta al giorno con una piccola quantità (due antischiacciamento) di un cibo per pesci fiocco tropicale. Lasciare un minimo di 3 ore tra ogni avanzamento. Mantenere un record alimentazione quotidiana per monitorare la risposta alimentazione / comportamento (buono, moderata o scarsa, rispetto ai controlli). Sifone i carri armati, almeno due volte a settimana (preferibilmente ogni giorno) per rimuovere qualsiasi cibo e le feci non consumati. Pulire i lati e il fondo dei recipienti almeno una volta alla settimana. Prendere campione d'acqua settimanales da ogni cisterna per confermare attività estrogenica (via schermo lievito) e la composizione chimica (via chimica analitica). Vedere le sezioni 1-3 per i dettagli di campionamento delle acque, l'estrazione e l'analisi. Nota: Per ogni esperimento, utilizzare il controllo di diluizione dell'acqua (controllo negativo), controllo positivo (E2 o EE2) più almeno tre diluizioni di effluenti (100, 50 e 25%) o test chimico per monitorare la risposta dose. Se nuove tecnologie sono testati, utilizzare compound / effluente con o senza trattamento (ad esempio, EE2 senza trattamento, EE2 con perossido TAML / idrogeno (H 2 O 2) trattamento 12; Figura 1). Figura 1. Schema che rappresenta disegno sperimentale di un in vivo vairone a testa grossa vitellogenin saggio biologico per determinare la rimozione di ecotossicità di 17α-etinilestradiolo con TAML trattamento delle acque / perossido. Il experimental impostare consiste di otto acquari vetro 11 L ciascuno alimentato con un flusso continuo di acqua. Soluzioni chimiche Stock individuali e acqua (filtrata de-clorurati) vengono consegnati alle camere di miscelazione. Le concentrazioni nominali (senza reazione) nei vasi di miscelazione sono 2 ng / L EE2, 80 Nm TAML e 0,16 mg / LH 2 O 2. Le soluzioni chimiche Stock (EE2, H 2 O 2 e TAML) sono preparati e dosati separatamente in modo che le reazioni iniziano nei vasi di miscelazione. Pesce (8 pesciolini fathead maschi per serbatoio) sono esposti alla miscela (s) dopo un tempo di contatto di reazione di circa 45 minuti. I campioni di acqua sono presi dai serbatoi di esposizione settimanale. I campioni di plasma sono presi da pesciolini fathead per misurare la vitellogenina biomarker estrogenica (VTG) da un gruppo basale, all'inizio dello studio, e tutti gli altri pesci dopo 21 giorni di esposizione. I trattamenti specifici sono: '-C'; controllo negativo (acqua di diluizione solo), '+'; controllo positivo di EE2,'+ H'; EE2 più H 2 O 2, '+ T'; EE2 più H 2 O 2 più TAML. Questa cifra è stata modificata da Mills et al. 2015 12. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Procedura di prova periodo di acclimatazione Misurare peso umido (g) di ogni pesce maschi sessualmente maturi, e allocare in modo casuale per ogni serbatoio (8 maschi per ogni serbatoio). Mantenere i pesci non allocato dallo stesso lotto e mantenerli nelle stesse condizioni di prova. Utilizzare questi pesci per sostituire tutti gli individui che mostrano segni di danni fisici o di una mancanza di condizioni durante il periodo di acclimatazione di 7 giorni. Assicurare alla fine del periodo di acclimatazione ciascun serbatoio di trattamento ha 8 maschi che sono pienamente acclimatati alle condizioni di prova. Prendere campioni di plasma 'di base' da ulteriori 8 maschi dalla stessa batch di pesci di sesso maschile. Seguire il metodo di campionamento del sangue nella sezione 4.4 e il metodo vitellogenina (VTG) analisi 4.5. Dopo il periodo di acclimatazione, consegnare scorte di dosaggio degli effluenti chimici o ai serbatoi di esposizione per 21 giorni, come descritto al punto 4.2.2 o 4.2.3. mortalità Monitor, comportamento e l'aspetto fisico del pesce in ogni replicano serbatoio giornaliero prima della prima alimentazione del giorno. Registra qualsiasi comportamento anomalo o di incidenti. Nota: Assicurare le condizioni ambientali e di tassi di alimentazione mantenere la salute dei pesci (punti 4.2.4 e 4.2.5). Il campionamento di pesce dopo periodo di esposizione di 21 giorni 12 ore prima del campionamento, smettere di alimentare i pesci. tubi micro-centrifuga Label per la raccolta di campioni di sangue, aggiungono ~ 5 ml di Aprotinin (un inibitore della proteasi) e disporli sul ghiaccio. Fare una soluzione di 500 mg / L di MS222 (anestetico) sciogliendo 500 mg di MS222 per 1 L di acqua de-clorurati (in precedenza acclimatatia 25 ± 1 ° C). Neutralizzare il MS222 a pH 7,4 ± 0,4 con 1 M NaOH. Spostare ogni pesce dal serbatoio nel MS222 tamponata. Conservare nella soluzione fino alla cessazione di ogni movimento opercolo (tipicamente 5 ± 1 min). Misurare e registrare la lunghezza delle forche (mm) sotto l'anestetico terminale. Utilizzare un bisturi monouso amputare la coda, e utilizzare un tubo hemocrit eparinizzata per raccogliere il sangue dall'arteria caudale (Figura 2). erogare con cautela il sangue nella provetta pre-etichettati e tenere in ghiaccio. Uccidere il pesce subito dopo aver disegnato il sangue. Conferma morte per cessazione permanente della circolazione e / o la distruzione del cervello. Misurare e registrare il peso del pesce totale (al più vicino 0,01 g), e sezionare i tessuti come richiesto. Centrifugare il sangue (7000 xg per 5 minuti a 4 ° C) in 2 ore di collezione. Trasferire il surnatante del plasma con una pipetta in nuova etichetta 0,4 ml microcentrifuga vascaES e memorizzare sul ghiaccio. Bloccare le provette contenenti plasma in ghiaccio secco in 30 min di centrifugazione e conservare a -80 ° C prima dell'analisi delle concentrazioni plasmatiche VTG. Figura 2. Foto che ritraggono maschio pesciolino Fathead (promelas), raccolta del plasma e la posizione dei testicoli. Al termine dell'esposizione di 21 giorni tutti i pesci devono essere uccisi per raccogliere campioni di sangue. Una volta sotto questo terminale lunghezza pesce anestetico (lunghezza della forcella, mm) devono essere misurati, seguito rapidamente da prelievo di sangue dall'arteria caudale Photo-A:. ​​Linea rossa tratteggiata indica la posizione per la coda amputazione (un bisturi monouso dovrebbe essere usato amputare la coda ). Photo-B mostra un tubo hemocrit eparinizzata utilizzato per raccogliere il sangue. Ogni pesce dovrebbe quindi essere ucciso immediatamente dopo il campione di sangue è stato preso, in questo caso l'intera testaè stato reciso dal corpo (Photo-C). Una volta che il pesce è stato ucciso cavità del corpo può essere aperto per rivelare gli organi interni. Photo-C mostra la posizione del testicolo (gonadi) in relazione alla vescica natatoria (SB) nei pesci ciprinidi, ad esempio, vairone a testa grossa, lasche, carpe, ecc Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Misurare le concentrazioni plasmatiche VTG con un kit di omologa VTG enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) progettato specificamente per pesciolini fathead. Preparare gli standard e buffer VTG come indicato nel protocollo del produttore. Diluire campione di plasma 1:50, 1: 5.000 e 1: 500.000 e li dosaggio in duplicato per ottenere letture all'interno della gamma curva standard VTG secondo le istruzioni del produttore. Seguire le linee guida del produttore per calcolare le concentrazioni di vitellogenina. </li> 5. valutazioni sul campo di Avanzato / Novel trattamento delle acque reflue tecnologie per mitigare estrogenica Attività Utilizzando In Vivo vitellogenina e intersessuali induzione a Roach (Rutilus rutilus) Cattura di scarafaggio selvatici che vivono a valle di scarichi trattamento delle acque reflue Nota: utilizzare lasca (Rutilus rutilus) o altre specie abbondante acqua dolce o salmastra di pesce, che sono gonochoristic e conosciuto per essere sensibili alle alterazioni del sistema endocrino estrogenica. La cattura di pesci utilizzando elettropesca, netting, intrappolando o altri metodi di pesca riconosciuti a seconda della situazione 13. Trasporto del pesce in vasche aerate torna al laboratorio per il campionamento. Preparare microprovette come descritto nella 4.4.2. Preparare tamponata MS222 come descritto in 4.4.3. Anestetizzare il pesce come descritto nella 4.4.4. Misurare la lunghezza del pesce e il peso sotto anestesia terminale. Prelevare il sangue dal caudale dell'arteria utilizzando disposable siringa eparina. Uccidi ogni pesce immediatamente dopo la raccolta campione di sangue. erogare con attenzione il sangue in provette da microcentrifuga pre-etichettati e tenere in ghiaccio. Preparare il plasma come descritto al punto 4.4.7 e misurare VTG mediante test ELISA (4.5). Utilizzando pinze rimuovere 2-3 scaglie di pesce da ogni pesce e porre in etichettate singolarmente buste di carta di piccole dimensioni. buste Conservare a temperatura ambiente in condizioni di asciutto per la determinazione dell'età pesce più tardi e l'analisi della crescita. cavità aperta corpo con un bisturi per rivelare gli organi interni. Estrarre l'intestino per rivelare la vescica natatoria con un gonadi posta a cavallo (Figura 2). Rimuovere con attenzione le gonadi in coppia con pinza sottile naso e posto in un flaconcino di vetro. Coprire le gonadi con fissativo di Bouin con un rapporto di 1:10 del tessuto: fissativo. Lasciare il tessuto in Bouin per 6-24 ore a seconda delle dimensioni del tessuto (fissativo penetra a 1 mm per ora). Una volta fissato, versare fuori fissativo una del BouinD Sostituire con il 70% alcool denaturato industriale (IMS). Conservare il tessuto fissato a temperatura ambiente fino tessuti sono trattati per istopatologia (paragrafo 5.3). La valutazione Campo base di attività estrogenica utilizzare in vivo vitellogenin e intersessuali induzione Roach Disegno sperimentale e impostare Nota: Impostare i carri armati e impianto pilota con largo anticipo del vivo lavoro partenza. Avviare i serbatoi scorre 3-4 settimane prima di qualsiasi aggiunta di pesci al sistema. Monitorare portate d'acqua, la qualità e le condizioni (pH, temperatura, ossigeno disciolto, ecc) regolarmente per assicurarsi che i parametri di acqua può essere mantenuta. Costruire grandi serbatoi acqua di rubinetto (ad esempio, 300-1,000 L) in loco presso l'impianto pilota, che può ricevere 'controllo' de-clorurati, standard di acque trattate (s) e Advanced effluente trattato (s) in parallelo. Fissare la pompa di aria / aeratori ai serbatoi. Set portate d'acqua per raggiungere almeno 6 serbatoio vscambi OLUME al giorno. Nota: Assicurarsi che i serbatoi sono ben isolati e ombreggiate per evitare eccessive fluttuazioni termiche giornaliere. Serbatoi progettazione per consentire l'osservazione del pesce, per alterazioni comportamentali (mancanza di alimentazione, ecc), segni di malattia e mortalità. Inizia l'esposizione di galleggiamento i sacchi di Roach (dalla fattoria pesce) nei rispettivi serbatoi per 1 ora. Aggiungere acqua serbatoio per le borse gradualmente fino a temperatura dell'acqua e le condizioni sono ambiente. Rilasciare il pesce in loro carri armati. Alimentare scarafaggio adulto ogni giorno sul cibo per pesci pellettato (formato 0,5-0,8). Alimentare scarafaggio giovanile quotidianamente sul piccolo pellet (pellet dimensioni 100-300) non-estrogenici di alimentazione 14 ad libitum, rettificato sulla base di mangimi non consumati. Tenere un registro giornaliero di alimentazione risposta alimentazione documentazione / comportamento (buono, moderata o scarsa, rispetto ai controlli). Prendere campioni di acqua settimanali da ogni cisterna per confermare attività estrogenica e la composizione chimica. See sezioni di 1-3 per i dettagli di metodi di campionamento e di analisi dell'acqua. L'esame istopatologico di pesce gonadi 15 Rimuovere con attenzione le gonadi sezionati e fissi (descritte nei passi 5.1.6 e 5.1.7) dal contenitore con pinzette e posto su un tagliere. Utilizzare una lama microtomo per tagliare ogni gonade in 3 parti (anteriore, media e posteriore) e da ogni parte tagliato una sezione trasversale spessore di 3-5 mm. Posizionare con cura tutti e sei i pezzi in una cassetta di plastica biopsia etichettato, e posto in tessuto processore utilizzando i tempi indicati nella tabella 4. Cera tessuti incorporare e sezione sul microtomo rotativo (3-5 micron). sezioni Trasferire vetrini rivestito etichettati bio-adesivo e posto diapositive su un piatto riscaldato (impostato a 45 ° C) per asciugare per 24 ore. Stain le diapositive, manualmente o tramite un coloratore automatico, utilizzando i tempi descritti in Tabella 5. Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul tessuto macchiato, elay un vetro coprioggetto sopra il mezzo di montaggio per proteggere i tessuti. In primo luogo, esaminare ogni diapositiva a basso ingrandimento (20X, cioè oggettiva 2X, con linee 10X dell'occhio di ingrandimento) per determinare il sesso e il numero di punti di allegati alla cavità del corpo 15. Prendere nota di eventuali anomalie per ogni pesce. Ad un maggiore ingrandimento (100X o 400X), esaminare il tessuto per valutare le fasi gametogenesi, anomalie e la presenza di ovociti in tessuto testicolare. Registrare la gravità della intersessualità utilizzando il seguente sistema di classificazione da 0 (tessuto maschio normale) a (tessuto ovarico 100%) 7 6 (vedi Tabella 6). numero di passo Trattamento Scopo Tempo (h) 1 70% IMS Disidratazione 3 2 90% IMS Disidratazione 2.5 3 95% IMS Disidratazione 1.5 4 100% IMS Disidratazione 1.5 5 100% IMS Disidratazione 1.5 6 100% IMS Disidratazione 1.5 7 100% IMS Disidratazione 1.5 8 agente di compensazione Istologia radura 1.5 9 agente di compensazione Istologia radura 1.5 10 agente di compensazione Istologia radura 1.5 11 CERA Cera infiltrazione 1.25 12 CERA Cera infiltrazione 1.25 20 hr TOTALE Tabella 4. regime di perfezionamento per la cera impregnazione tessuti per istopatologia. I tessuti devono essere trattati in un processatore automatico. I tessuti devono essere immersi nelle soluzioni dettagliate per il periodo di tempo specificato. Stain no. Macchia Scopo Tempo (min) 1 agente di Istologia Clearing Si scioglie la cera 15 2 <td> 100% IMS Idratazione 2 3 90% IMS Idratazione 2 4 70% IMS Idratazione 2 5 ACQUA RUBINETTO (in esecuzione) Sciacquare 2 6 HAEMOTOXYLIN nuclei delle cellule macchie blu 10 7 ACQUA RUBINETTO (in esecuzione) rimuovere l'eccesso 10 8 acidificato IMS declorazione 20 sec 9 ACQUA RUBINETTO (in esecuzione) Sciacquare 20 sec 10 Lico 3 sale 20 sec 11 ACQUA RUBINETTO (in esecuzione) Sciacquare 20 sec 12 1% EOSINA (acquosa) Macchie di colore rosa citoplasma 20 sec 13 ACQUA RUBINETTO (in esecuzione) rimuovere l'eccesso 5 14 70% IMS Disidratazione 2 15 90% IMS Disidratazione 2 16 100% IMS Disidratazione 5 17 agente di Istologia Clearing Rimuovere IMS, legante 5 Tabella 5. Soluzioni e tempi di immersione per Ematossilina e eosina (H & E) colorazione dei tessuti gonadici pesce. I vetrini deve essere collocato in ogni bagno per la allocated volta in sequenza. H & E colorazione dei tessuti è necessaria per determinare l'impatto di sviluppo o organizzative di effluenti di acque reflue estrogenici sulle gonadi di pesce. Punto Sezione Descrizione 0 Normale testicoli maschili 1 Multifocale ovotestis con 1-5 ovociti (di solito singolarmente) sparsi tra il tessuto testicolare 2 ovotestis multifocale, 6-20 ovociti spesso in piccoli gruppi sparsi tra il tessuto testicolare 3 ovotestis multifocale, 21-50 ovociti in cluster 4 > 50 e <100 ovociti. Sezione è solitamente multifocale ed ha l'aspetto di un mosaico di provatessuto icular e ovarico. 5 > 100 ovociti, di solito multifocale ma potrebbe anche essere focale con zone chiaramente identificabili di tessuto ovarico e testicolare separata dal tessuto testicolare. 6 > 50 per cento del tessuto gonadico sulla sezione è ovarico ed è chiaramente separata dal tessuto testicolare da parte delle cellule epiteliali e tessuti fagociti. 7 100 per cento del tessuto gonadico sulla sezione è ovarico. Tabella 6. sistema di punteggio per valutare la gravità della condizione di intersessualità in scarafaggio. Istologicamente vetrini preparati di tessuto gonadico devono essere esaminati al microscopio ottico, a 20X, 100X e 400X ingrandimento, per valutare eventuali anomalie e la presenza di ovociti in tessuto testicolare. Questa tabella viene modificata da Jobling <em> et al. 2006 6.