Summary

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Published: October 31, 2016
doi:

Summary

Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.

Abstract

La metilazione è una delle modificazioni epigenetiche essenziali al DNA, che è responsabile per la precisa regolazione dei geni necessari per lo sviluppo stabile e differenziazione dei diversi tipi di tessuto. Disregolazione di questo processo è spesso il segno distintivo di varie malattie come il cancro. Qui, si delineano uno dei recenti tecniche di sequenziamento, Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), utilizzato per quantificare la metilazione in vari tessuti normali e di malattia per i grandi coorti di pazienti. Descriviamo un protocollo dettagliato di questo approccio arricchimento affinità con un oleodotto bioinformatica per raggiungere quantificazione ottimale. Questa tecnica è stata utilizzata per sequenziare centinaia di pazienti in vari tipi di cancro come parte del progetto 1.000 methylome (Cancer Methylome System).

Introduction

Regolazione epigenetica di geni attraverso metilazione del DNA è uno dei meccanismi essenziali necessari per determinare il destino della cellula dalla differenziazione stabile di diversi tipi di tessuto nel corpo 1. Disregolazione di questo processo è stato conosciuto per causare varie malattie tra cui il cancro 2.

Questo processo comporta principalmente l'aggiunta di gruppi metilici sul residuo citosina in dinucleotidi CpG del DNA 3. Esistono alcune tecniche diverse attualmente utilizzate per indagare questo meccanismo, ciascuno con i propri vantaggi come indicato in molti studi 2-8. Qui discuteremo una di queste tecniche chiamati Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), dove utilizziamo una tecnica di affinità arricchimento per identificare le regioni metilato del DNA. Questa tecnica si basa sulla capacità metil-legame della proteina MBD2 per arricchire i frammenti di DNA genomico contenenti denaturato siti CpG. Utilizziamo un kit di arricchimento DNA metilato commercialeper l'isolamento di tali regioni metilati. Il nostro laboratorio ha proiettato in centinaia di campioni di pazienti con questa tecnica e qui mettiamo a disposizione un protocollo ottimizzato completo, che può essere utilizzato per studiare grandi coorti di pazienti.

Come evidente con qualsiasi tecnologia di sequenziamento di prossima generazione, MBDCap-ss richiede anche un approccio bioinformatico specifiche al fine di quantificare con precisione i livelli di metilazione attraverso i campioni. Ci sono stati molti studi recenti, nel tentativo di ottimizzare il processo di normalizzazione e l'analisi dei dati di sequenziamento 9, 10. In questo protocollo, dimostriamo uno di questi metodi di attuazione di un approccio unico di recupero lettura – LONUT – seguita dalla normalizzazione lineare di ogni campione, al fine di consentire il confronto imparziali attraverso gran numero di campioni di pazienti.

Protocol

Tutti i tessuti sono ottenuti a seguito approvazione del comitato Institutional Review Board e quando tutti i partecipanti acconsentito ad entrambe le analisi molecolari e studi di follow-up. I protocolli sono approvati dal Comitato studi sugli esseri umani presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio. 1. Metil-legame al DNA di cattura (MBDCap) Raccolta dei campioni e l'isolamento del DNA Raccogliere tumore alla rinfusa o normali campioni di tess…

Representative Results

Abbiamo usato MBDCap-seq per studiare alterazioni di metilazione del DNA in un gran numero di pazienti da diversi tipi di cancro compresi seno 12, dell'endometrio 13, prostata 14, e tumori del fegato, tra gli altri. Qui mostriamo alcune informazioni dallo studio del cancro al seno pubblicato di recente 12. In questo caso, abbiamo utilizzato l'intero approccio di sequenziamento del genoma per identificare isole CpG che sono differenziale metilato nei tumori rispetto al normale nelle diverse…

Discussion

La tecnica MBDCap-seq è un approccio arricchimento affinità 3, considerata un'alternativa economica nell'ambito delle indagini coorti con un grande numero di pazienti 15. Il gasdotto presentato qui descrive un approccio globale da approvvigionamento di esempio per l'analisi e l'interpretazione dei dati. Uno dei passi più importanti è la creazione di una procedura di amplificazione PCR per migliorare l'efficienza della PCR delle regioni GC arricchito nel genoma come questo è dove si verifica la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è sostenuto da CPRIT Research Training Award RP140105, così come in parte sostenuto da Stati Uniti National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01 GM114142 e da William & Ella Owens Medical Research Foundation.

Materials

Methylminer DNA enrichment Kit Invitrogen ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device diagenode B01020001
3M sodium acetate pH 5.2 Sigma S7899 100ml
SPRIworks Fragment Library System I Beckman Coulter A50100 Fully automated library construction system
Adapter Primers Bioo Scientific 514104 PCR primer mix
Qubit Invitrogen Q32854 Fluorometric Quantitation System
PCR master mix KAPA scientific KK2621 PCR master mix
AMPure XP Beckman Coulter A63881 PCR Purification beads
EB Buffer Qiagen 19086
HiSeq 2000 Sequencing System Illumina

References

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Jadhav, R. R., Wang, Y. V., Hsu, Y., Liu, J., Garcia, D., Lai, Z., Huang, T. H. M., Jin, V. X. Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues. J. Vis. Exp. (116), e54131, doi:10.3791/54131 (2016).

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