Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.
Abstract
A metilação é uma das modificações epigenética essenciais para o DNA, o qual é responsável pela regulação precisa dos genes necessários para o desenvolvimento e diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos. A desregulação deste processo é frequentemente a característica de diversas doenças como o cancro. Aqui, nós descrevemos uma das técnicas de sequenciação recentes, Metil-Binding sequenciação de ADN de captura (MBDCap-SEQ), usada para quantificar a metilação em vários tecidos normais e de doença para grandes grupos de pacientes. Descreve-se um protocolo detalhado desta abordagem de enriquecimento por afinidade ao longo de uma conduta bioinformática para alcançar quantificação ideal. Esta técnica tem sido utilizada para sequenciar centenas de pacientes em vários tipos de câncer, como parte do projeto methylome 1.000 (Sistema Methylome Câncer).
Introduction
Regulação epigenética de genes por meio de metilação do ADN é um dos mecanismos essenciais necessários para determinar o destino da célula por diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos do corpo 1. A desregulação deste processo tem sido conhecido por causar diversas doenças, incluindo o cancro 2.
Este processo envolve, principalmente, a adição de grupos metilo no resíduo de citosina nos dinucleótidos CpG de ADN 3. Existem algumas técnicas diferentes, actualmente utilizados para investigar este mecanismo, tendo cada um as suas próprias vantagens, conforme descrito em muitos estudos 2-8. Aqui vamos discutir uma destas técnicas chamados metil-Binding Captura de sequenciamento de DNA (MBDCap-seq), onde usamos uma técnica de enriquecimento de afinidade para identificar regiões metiladas do DNA. Esta técnica baseia-se na capacidade de ligação de metilo da proteína MBD2 para enriquecer os fragmentos de DNA genómico contendo locais CpG metilados. Nós utilizamos um kit de enriquecimento de DNA metilado comercialpara o isolamento destas regiões metiladas. O nosso laboratório fez a triagem centenas de amostras de pacientes, utilizando esta técnica e aqui nós fornecemos um protocolo optimizado abrangente, que pode ser usado para investigar grandes grupos de pacientes.
Como é evidente, com qualquer tecnologia de sequenciamento de próxima geração, MBDCap-seq também requer uma abordagem bioinformática específicos, a fim de quantificar com precisão os níveis de metilação através das amostras. Tem havido muitos estudos recentes em um esforço para otimizar o processo de normalização e análise dos dados de sequenciamento 9, 10. Neste protocolo, demonstramos um destes métodos de aplicação de uma abordagem única de recuperação de leitura – LONUT – seguido pela normalização linear de cada amostra, a fim de permitir comparações imparciais toda grande número de amostras de doentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica MBDCap-seq é uma abordagem de enriquecimento de afinidade 3, considerada como uma alternativa de custo eficaz quando se investiga coortes com um grande número de pacientes 15. O gasoduto apresentado aqui descreve uma abordagem abrangente, desde a colheita de amostra para análise de dados e interpretação. Um dos passos mais importantes é a criação de um procedimento de amplificação por PCR para melhorar a eficiência da PCR das regiões GC enriquecido no genoma como este é onde ocorre a metilação…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho é apoiado pelo CPRIT Research Training Award RP140105, bem como parcialmente suportado pelo US National Institutes of Health (NIH) concede R01 GM114142 e por William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
