Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.
Abstract
Methylierungs ist eines der wesentlichen epigenetische Modifikationen an der DNA, die für die genaue Regulierung von Genen verantwortlich ist, die für eine stabile Entwicklung und Differenzierung von verschiedenen Gewebetypen. Dysregulation dieses Verfahrens ist oft das Kennzeichen von verschiedenen Krankheiten wie Krebs. Hier haben wir eine der jüngsten Sequenzierungstechniken skizzieren, Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), verwendet Methylierung in für große Patientenkohorten verschiedenen normalen und Krankheit Gewebe zu quantifizieren. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll dieser Affinitätsanreicherung Ansatz zusammen mit einer Bioinformatik Pipeline optimale Quantifizierung zu erreichen. Diese Technik ist verwendet worden Hunderte von Patienten in verschiedenen Krebsarten als Teil der 1000 Methyloms Projekt (Cancer Methylome System) zu sequenzieren.
Introduction
Epigenetischen Regulation der Gene durch DNA – Methylierung ist eine der wesentlichen Mechanismen erforderlich , um die Zellschicksal durch stabile Differenzierung verschiedener Gewebearten in dem Körper 1 zu bestimmen. Dysregulation dieses Verfahrens wurde 2 verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs zu verursachen bekannt.
Dieses Verfahren umfasst im Wesentlichen die Zugabe von Methylgruppen auf dem Cytosin – Rest in der CpG Dinukleotide DNA 3. Es gibt verschiedene Techniken , die derzeit diesen Mechanismus zu untersuchen, die jeweils ihre eigenen Vorteile, wie 2-8 in vielen Studien beschrieben. Hier werden wir eine dieser Techniken diskutieren namens Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), wo wir eine Affinität Anreicherungsmethode verwenden, um methylierte Bereiche der DNA zu identifizieren. Diese Technik baut auf dem methyl-Bindungsfähigkeit des MBD2-Proteins für die genomische DNA-Fragmente enthalten, methylierte CpG-Stellen zu bereichern. Wir verwenden eine kommerzielle methylierte DNA-Anreicherung Kitfür die Isolierung dieser methylierten Regionen. Unser Labor hat Hunderte von Patientenproben mit dieser Technik gezeigt und hier bieten wir ein umfassendes optimiertes Protokoll, das verwendet werden kann große Patientengruppen zu untersuchen.
Wie sich bei jeder Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation erfordert MBDCap-seq auch einen spezifischen Ansatz der Bioinformatik, um das Niveau der Methylierung in den Proben genau zu quantifizieren. Es wurden in dem Bemühen viele neuere Studien, die Normalisierung und Analyseprozess der Sequenzierungsdaten 9, 10 zu optimieren. In diesem Protokoll zeigen wir eine dieser Methoden eine einzigartige Lese Recovery-Ansatz der Umsetzung – LONUT – gefolgt von linearen Normalisierung jeder Probe, um unvoreingenommene Vergleiche über große Anzahl von Patientenproben zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die MBDCap-seq – Technik ist eine Affinitätsanreicherung Ansatz 3 als kostengünstige Alternative angesehen , wenn Kohorten mit einer großen Anzahl von Patienten 15 zu untersuchen. Die Pipeline präsentiert hier beschreibt einen umfassenden Ansatz von der Probenbeschaffung bis zur Datenanalyse und Interpretation. Einer der wichtigsten Schritte setzt ein PCR-Amplifikationsverfahren, um die Effizienz der PCR GC angereicherte Regionen in dem Genom zu verbessern, da dies ist, wo die DNA-Methylierung stattfindet. Auch ist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wird von CPRIT Forschung Training Award RP140105 unterstützt, sowie teilweise von US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) gewährt R01 GM114142 und von William & Ella Owens Medical Research Foundation unterstützt.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
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