患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング
Summary
ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。
Abstract
メチル化は、異なる組織型の安定的発展と分化に必要な遺伝子の正確な制御を担当してDNAに不可欠なエピジェネティック修飾の一つです。このプロセスの調節不全は、多くの場合、癌のような種々の疾患の特徴です。ここでは、最近の配列決定技術、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-SEQ）のいずれかを概説し、大規模患者コホートのための種々の正常および疾患組織中のメチル化を定量化するために使用されます。私たちは、最適な定量化を達成するために、バイオインフォマティクスパイプラインに沿って、この親和性富化アプローチの詳細なプロトコルを記述します。この技術は千methylomeプロジェクト（がんMethylomeシステム）の一環として、様々な癌タイプにわたって数百人の患者を配列決定するために使用されてきました。
Introduction
DNAメチル化を介して、遺伝子のエピジェネティックな調節は、本体1内の異なる組織型の安定した分化によって細胞運命を決定するために必要不可欠な機構の1つです。このプロセスの調節不全は、癌2を含む様々な疾患を引き起こすことが知られています。
このプロセスは、主にDNA 3のCpGジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル基の付加を含みます。現在、多くの研究2-8に概説したように、それぞれが独自の利点を有し、このメカニズムを調査するために使用されるいくつかの異なる技術があります。ここでは、我々は、DNAのメチル化領域を同定するために、親和性濃縮技術を使用してメチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-SEQ）と呼ばれるこれらの技術のいずれかを説明します。この技術は、メチル化CpG部位を含むゲノムDNA断片を濃縮するMBD2タンパク質のメチル結合能力の上に構築します。私たちは、商業メチル化DNA濃縮キットを利用しますこれらのメチル化領域を単離するため。私たちの研究室では、この技術を用いて患者サンプルの数百人をスクリーニングしており、ここでは大規模な患者コホートを調査するために使用することができる総合的な最適化されたプロトコルを、提供します。
任意の次世代シーケンシング技術で明らかなように、MBDCap-seqのも、正確にサンプル全体にメチル化のレベルを定量するために、特定のバイオインフォマティクスのアプローチが必要です。配列決定データ9、10の正規化と分析プロセスを最適化するために多くの最近の研究がなされています。 LONUT – – 患者多数のサンプルを横切って、公正な比較を可能にするために、各サンプルの線形正規化に続いて、このプロトコルでは、我々は、一意のリードリカバリ手法を実装するこれらの方法のいずれかを示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
MBDCap-seqの技術は、患者15に多数のコホートを調査する際に、コスト効果の高い代替として考え親和性富化アプローチ3、です。ここで紹介するパイプラインは、データ分析と解釈にサンプル調達から包括的アプローチを説明します。最も重要なステップの一つは、DNAのメチル化が起こる場合、これはそのままゲノム中のGC富化領域のPCR効率を改善するために、PCR増幅手順を設定します。また?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作業はCPRIT研究研修賞RP140105でサポートされているだけでなく、部分的にR01 GM114142を許可し、ウィリアム＆エラ・オーエンス医学研究財団（NIH）米国国立衛生研究所によってサポートされています。
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
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