ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض
Summary
هنا نقدم بروتوكول للتحقيق في الحامض النووي الجينوم في الدراسات المريض السريرية واسعة النطاق الفحص باستخدام ميثيل ربط تسلسل الحمض النووي لقطة (MBDCap تسلسل أو مليون برميل يوميا وما يليها) التكنولوجيا وخط أنابيب تحليل المعلومات البيولوجية اللاحقة.
Abstract
مثيلة هي واحدة من تعديلات جينية الأساسية على الحمض النووي، وهي المسؤولة عن تنظيم دقيق للجينات اللازمة للتنمية مستقرة والتفريق بين أنواع الأنسجة المختلفة. التقلبات في هذه العملية وغالبا ما يكون السمة المميزة لمختلف الأمراض مثل السرطان. هنا، ونحن الخطوط العريضة واحدة من تقنيات التسلسل الأخيرة، ميثيل ربط الحمض النووي التقاط تسلسل (MBDCap وما يليها)، وتستخدم لتحديد مثيلة في مختلف الأنسجة الطبيعية والمرض لأفواج المرضى كبيرة. وصفنا بروتوكول مفصلة لهذا النهج تخصيب تقارب جنبا إلى جنب مع خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحقيق الكمي الأمثل. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل مئات المرضى عبر أنواع السرطان المختلفة كجزء من مشروع methylome 1000 (سرطان نظام Methylome).
Introduction
تنظيم جينية للجينات من خلال الحامض النووي هو إحدى الآليات الأساسية اللازمة لتحديد مصير الخلية عن طريق التمايز مستقر من أنواع الأنسجة المختلفة في الجسم 1. وقد عرفت ديسريغولاتيون من هذه العملية أن تسبب الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان 2.
هذه العملية تنطوي أساسا على إضافة مجموعات الميثيل على بقايا السيتوزين في dinucleotides الدليل السياسي الشامل من الحمض النووي 3. هناك عدد من التقنيات المختلفة المستخدمة حاليا للتحقيق في هذه الآلية، ولكل منها ميزاتها الخاصة على النحو المبين في العديد من الدراسات 2-8. هنا سوف نناقش واحدة من هذه التقنيات يسمى ميثيل ربط الحمض النووي التقاط تسلسل (MBDCap وما يليها)، حيث نستخدم تقنية تخصيب تقارب لتحديد مناطق مثيلة الحمض النووي. وتستند هذه التقنية على قدرة ملزم الميثيل من البروتين MBD2 لإثراء لشظايا الحمض النووي الجيني التي تحتوي على مواقع الدليل السياسي الشامل مثيلة. نحن نستخدم مجموعة تخصيب DNA مثيلة التجاريةلعزل هذه المناطق ميثليته. وقد فحص مختبرنا مئات العينات من المرضى باستخدام هذه التقنية، ونحن هنا نقدم بروتوكول الأمثل الشامل، والتي يمكن استخدامها لتحقيق أفواج المرضى كبيرة.
كما هو واضح مع أي تكنولوجيا تسلسل الجيل المقبل، يتطلب MBDCap وما يليها أيضا نهجا المعلوماتية الحيوية محددة من أجل تحديد دقيق لمستويات مثيلة عبر العينات. كانت هناك العديد من الدراسات التي أجريت مؤخرا في محاولة لتحسين عملية التطبيع وتحليل البيانات التسلسل 9 و 10. في هذا البروتوكول، ونحن لشرح واحد من هذه الأساليب تنفيذ نهج الانتعاش قراءة فريدة من نوعها – LONUT – يليه تطبيع الخطي من كل عينة من أجل تمكين مقارنات مشاركات عبر عدد كبير من عينات المرضى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية MBDCap وما يليها هو نهج تخصيب تقارب 3، التي تعتبر بديلا فعالا من حيث التكلفة عند التحقيق الأفواج مع عدد كبير من المرضى 15. خط أنابيب المعروضة هنا يصف اتباع نهج شامل من شراء عينة لتحليل البيانات وتفسيرها. واحدة من أهم الخطوات ووضع إجراء التضخيم PCR لتحسين كفاءة PCR من ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل CPRIT بحوث التدريب جائزة RP140105، وكذلك جزئيا بدعم من المعاهد الامريكية الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01 GM114142 ومؤسسة البحوث الطبية وليام وإيلا أوينز.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
