רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.
Abstract
מתילציה היא אחד השינויים אפיגנטיים החיוניים ל- DNA, האחראית על ויסות המדויק של הגנים דרושים התפתחות והתמיינות יציבות של סוגי רקמות שונים. חוסר ויסות של תהליך זה הוא לעתים קרובות סימן ההיכר של מחלות שונות כמו סרטן. כאן, אנו מתארים אחת טכניקות הרצף האחרונות, מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), המשמש לכמת מתילציה שונה רקמות בריאות ומחלות עבור קבוצות גדולות של מטופלים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של גישת העשרת זיקה זו יחד עם צינור ביואינפורמטיקה להשיג כימות אופטימלי. טכניקה זו נעשה שימוש כדי רצף מאות חולים ברחבי סוגי סרטן שונים כמו חלק מפרויקט methylome 1,000 (מערכת Methylome סרטן).
Introduction
תקנה אפיגנטיים של גנים באמצעות מתילציה DNA היא אחד המנגנונים החיוניים הדרושים כדי לקבוע את גורל התא על ידי בידול יציב של סוגי רקמות שונים בגוף 1. חוסר ויסות של תהליך זה כבר ידוע לגרום למחלות שונות, כולל סרטן 2.
תהליך זה בעיקר יהיה כרוך בתוספת של קבוצות מתיל על שאריות ציטוזין ב CPG dinucleotides של DNA 3. ישנן כמה טכניקות שונות המשמשים כיום כדי לחקור את המנגנון הזה, שלכל אחד מהם יתרונות משלהם כפי שמתואר מחקרים רבים 2-8. כאן נדונו באחת הטכניקות הללו בשם מתיל-כריכת רצף לכיד DNA (MBDCap-seq), שבו אנו משתמשים בטכניקת העשרת זיקה לזהות אזורים מפוגלים של ה- DNA. טכניקה זו בונה על היכולת מחייב מתיל של החלבון MBD2 להעשיר עבור קטעי דנ"א גנומי המכיל אתרים CPG מפוגל. אנו מנצלים ערכת העשרה DNA מסחרית מפוגלתעבור הבידוד של אזורים המפוגלים אלה. המעבדה שלנו הוקרנה מאות דגימות חולות באמצעות טכניקה זו וכאן אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה מקיף, אשר ניתן להשתמש בם כדי לחקור קבוצות גדולות של מטופלים.
כפי שעולה עם כל טכנולוגית רצף של הדור הבא, MBDCap-seq גם דורש גישה ביואינפורמטיקה ספציפית על מנת לכמת את הרמות של מתילציה במדויק על פני הדגימות. נעשו מחקרים רבים שנערכו לאחרונה במאמץ כדי לייעל את תהליך הנורמליזציה וניתוח של נתוני רצף 9, 10. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים באחת השיטות הבאות יישום גישת התאוששות קריאה ייחודית – LONUT – ואחריו נורמליזציה ליניארי של כל דגימה על מנת לאפשר השוואות משוחדות על פני מספר רב של דגימות חולות.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת MBDCap-seq היא גישת העשרת זיקת 3, נחשבת כאלטרנטיבה חסכונית כאשר חוקרים מחזורים עם מספר רב של חולים 15. הצינור המובא כאן מתאר גישה מקיפה מן רכש מדגם ניתוח נתונים ופרשנות. אחד הצעדים החשובים ביותר הוא הגדרת הליך הגברת PCR כדי לשפר את יעילות PCR של האזורים המועשרים GC בגנום …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי CPRIT ומחקר הדרכה פרס RP140105, כמו גם נתמך בחלקו על ידי ארה"ב National Institutes of Health (NIH) מעניק R01 GM114142 ועל ידי ויליאם & Ella אוונס רפואי Research Foundation.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
